ESTM - Mestrado em Biotecnologia dos Recursos Marinhos
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Browsing ESTM - Mestrado em Biotecnologia dos Recursos Marinhos by advisor "Baptista, Teresa Maria Coelho"
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- Atividade das enzimas de defesa antioxidante do fígado de pós-larvas de robalo (Dicentrarchus labrax), alimentados com diferentes níveis de vitaminasPublication . Almeida, Catarina Santos de; Baptista, Teresa Maria Coelho; Ribeiro, Maria Laura BragaDurante os estadios iniciais de desenvolvimento, as larvas de peixes marinhos exibem elevadas taxas de crescimento e de diferenciação dos seus tecidos e órgãos. Portanto, é esperado elevado metabolismo e diferenciação celular, com consequente produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). Estes produtos do metabolismo são conhecidos por causar stress oxidativo, com efeito prejudicial no crescimento e sobrevivência das larvas de peixes. Esses organismos têm defesas antioxidantes eficazes para proteger as células do stress oxidativo, mas a eficiência desses mecanismos depende do suprimento adequado de antioxidantes na dieta, como as vitaminas. Portanto, é possível e evidente que a dieta possa ter um papel protetor contra os ROS. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade das enzimas do stress oxidativo em pós-larvas de robalo alimentadas com diferentes formulações vitamínicas. De modo a perceber se essas formulações eram favoráveis para garantirem sobrevivência a estes organismos, o desempenho do crescimento foi determinado de acordo com as medidas do peso seco e comprimento total. Além disso, para avaliar se as dietas proporcionaram defesa contra o stress oxidativo, analisou-se as respostas das enzimas relacionadas com as defesas antioxidantes (SOD, CAT e GPx). O possível dano oxidativo devido à peroxidação lipídica foi também avaliado pela formação de malondialdeído. Com base nos resultados obtidos foi possível verificar que as pós-larvas de robalo alimentadas com as diferentes dietas experimentais apresentaram crescimento similar entre os tratamentos, revelando que não afetaram o seu desempenho e sobrevivência. As dietas também não afetaram significativamente as atividades das enzimas antioxidantes entre as dietas. Relativamente aos eventuais danos oxidativos, a análise da peroxidação lipídica indicou que os níveis de produção de malondialdeído produzidos não foram também significativos. Conclui-se que as formulações vitamínicas das dietas não afetaram o sistema antioxidante nem causaram danos nos organismos em estudo, permitindo assim um melhor desempenho no crescimento. Desse modo, este tipo de formulações aqui testadas tem potencial para serem suplementos benéficos a incluir nas dietas inertes para aquacultura, mantendo ou melhorando a defesa antioxidante e reduzindo as eventuais perdas que possam surgir devido à exposição da ação dos ROS.
- Desenvolvimento de uma ferramenta multiplex-PCR para a deteção de Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi e Yersinia ruckeri em peixes de aquaculturaPublication . Ferreira, Marco António Macieira; Afonso, Clélia Paulete Correia Neves; Baptista, Teresa Maria CoelhoAs estirpes patogénicas em estudo provocam doenças devastadoras em aquaculturas de peixes da família Salmonidae e Centropomidae (e.g. Salmão e Robalo, respetivamente). Em casos de surto, as taxas de mortalidade são extremamente elevadas e as consequências são devastadoras a nível económico, causando elevados prejuízos, visto existir uma enorme dificuldade em detetar as infeções a tempo. Com o aumento da importância e do valor económico da aquacultura tornou-se fulcral que as estirpes Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi e Yersinia ruckeri consigam ser detetadas a tempo de modo a evitar as respetivas doenças e evitar contaminações em massa. Presentemente existem algumas ferramentas, como por exemplo, vacinas e antibióticos que possuem diferentes graus de eficácia para combater as doenças provocadas por estas estirpes, no entanto são escassas as ferramentas que detetem precocemente a presença de estirpes patogénicas, de modo a atuar de forma eficaz. As ferramentas PCR são cada vez mais utilizadas, com diversas finalidades, entre as quais a deteção de patógenos, um desenvolvimento essencial na prevenção, e assim, combate a estas doenças. Dentro das várias técnicas de PCR, o multiplex-PCR tem várias vantagens comparando com o PCR convencional, destacando-se a poupança de tempo e recursos, devido à possibilidade de deteção de várias estirpes numa única reação. A rapidez de deteção de uma ferramenta de multiplex-PCR juntamente com a sua simplicidade e baixo custo torna, uma possível ferramenta de multiplex-PCR, essencial para a deteção atempada das estirpes patogénicas prevenindo a infeção, visto que as estirpes podem ser detetadas antes que se tornem infeciosas, e o contágio para outros peixes nos tanques de aquacultura. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e testar uma ferramenta de multiplex-PCR, procurando uma forma rápida, económica e eficaz para a deteção precoce de peixes infetados com as estirpes referidas de modo e evitar a sua propagação em tanques de aquacultura. Conseguiu-se em três das quatro estirpes uma deteção até 0,6 pg/μl e para a restante, Vibrio harveyi, 0,016 ng/μl. A ferramenta desenvolvida demonstra uma sensibilidade elevada, essencial para que possa ser implementada com sucesso, permitindo a deteção precoce destas bactérias patogénicas em peixes e potencialmente outros organismos.
- Desenvolvimento e avaliação de vacinas de DNA contra Photobacterium damselae subsp. piscicidaPublication . Santos, Beatriz Isabel Pires dos; Baptista, Teresa Maria Coelho; Monteiro, Gabriel; Mateus, MaríliaUma das bactérias frequentemente encontrada em aquacultura é Photobacterium damselae subsp. piscicida. Esta bactéria é responsável pela doença fotobacteriose, afetando mais de vinte espécies. Um dos grandes fatores de virulência desta bactéria é a capacidade de adquirir ferro do hospedeiro pela produção de sideróforos específicos, piscibactinas, sendo esta transportada pela proteína FrpA. Já existem alguns tipos de vacinas no mercado contra fotobacteriose, mas nenhuma é uma vacinas de DNA. Este trabalho tem como objetivo construir plasmídeos que codificam a sequência genética da proteína FrpA ou fragmentos desta proteína escolhidos por terem elevado potencial imunológico, desenvolver e produzir vacinas de DNA utilizando estes plasmídeos e verificar a sua eficácia, testando-as em robalos juvenis e avaliando a sua eficácia, recorrendo a ELISA indireto e à análise da percentagem relativa de sobrevivência (RPS). Desenharam-se três plasmídeos: um com o gene completo da proteína FrpA, pVAX-FrpA-GFP, e dois plasmídeos com sequencias genómicas dos fragmentos escolhidos, pVAX-Frag1-GFP e pVAX-Frag6-GFP. Apenas se conseguiu obter os plasmídeos com os fragmentos. Estes plasmídeos foram produzidos em quantidade necessária para vacinar 78 robalos (com certa de 15 g) por tratamento, havendo 4 tratamentos em triplicado. No tratamento 1 foi utilizada uma vacina contendo pVAX-GFP suplementada com adjuvante Montanide ISA 763 A VG, nos tratamentos 2 e 3 foram utilizadas vacinas suplementadas com o mesmo adjuvante, mas contendo os plasmídeos pVAX-Frag1-GFP e pVAX-Frag6-GFP, respetivamente. Por último, no tratamento 4 foi utilizada uma vacina contendo também pVAX-Frag6-GFP, porém suplementada com o adjuvante Montanide Gel 02 PR. A dose administrada de vacina para cada tratamento foi de 1,2 μg pDNA/g peixe. Os peixes controlo foram injetados com PBS estéril. Os peixes tratados com vacinas suplementadas com Montanide ISA contendo os plasmídeos pVAX-GFP e pVAX-Frag1-GFP sofreram mortalidade, no tempo de imunização, de 12% e 26%, respetivamente. Esta pode estar relacionada com os efeitos secundários deste adjuvante. Por outro lado, apenas em peixes vacinados com este adjuvante foram detetados títulos de anticorpos e aumento destes ao longo do tempo (de 15 dias para 30 dias após vacinação), nos ensaios ELISA indireto. Todas as vacinas concederam valores de RPS elevados após infeção, superiores a 70%. A vacina pVAX-Frag6-GFP suplementada com Montanide ISA alcançou um RPS de 93%, seguida da vacina contendo o vetor pVAX-GFP com um RPS de 86% e depois, as vacinas contendo os plasmídeos pVAX-Frag1-GFP e pVAX-Frag6-GFP suplementadas com Montanide ISA e Montanide Gel, respetivamente, com um RPS de 73%. Os peixes de controlo, injetados com PBS obtiveram um valor de RPS de 0%, não havendo sobrevivência após 5 dias de infeção.
- Desenvolvimento e validação de uma ferramenta molecular de multiplex-PCR para a deteção de Vibrio alginolyticus, Vibrio anguillarum e Vibrio harveyi em peixes de aquaculturaPublication . Ferreira, Ana Rita Carvalho; Afonso, Clélia Paulete Correia Neves; Baptista, Teresa Maria CoelhoO sector aquícola tem crescido largamente nos últimos anos, devido à procura crescente de alimento em todo o mundo e à diminuição dos recursos pesqueiros. Contudo, a presença de doenças infeciosas é uma constante ameaça podendo resultar em enormes perdas económicas neste setor. Algumas dessas doenças são causadas por bactérias, entre as quais se incluem espécies do género Vibrio. A criação de métodos de deteção prévia da presença destas bactérias em aquaculturas, como forma de prevenir potenciais surtos com consequências graves, é de uma importância extrema. O PCR é uma ferramenta molecular que permite a deteção rápida e específica destes agentes patogénicos, sendo utilizada neste tipo de situações com sucesso. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar uma ferramenta molecular de multiplex-PCR que permita a deteção precoce da presença de Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi e Vibrio alginolyticus, três dos agentes patogénicos que causam perdas avultadas em aquaculturas. As condições reacionais do multiplex PCR foram otimizadas de forma a estabelecer as condições de utilização desta ferramenta de forma eficaz, sensível e rigorosa. Foram utilizados 35 ciclos na amplificação, a temperatura de annealing ótima é de 58ºC e a concentração ideal de MgCl2 é de 7,5 mM. Os resultados indicam que a extração de ADN deve ser efetuada com kits apropriados, pois o método de fervura não se mostra suficientemente eficaz. Validou-se com sucesso a ferramenta em tecidos de linguados (Solea senegalensis) provenientes de aquacultura, tendo sido assim validada a utilização desta técnica na deteção precoce das espécies de Vibrio estudadas, em condições reais de uma aquacultura. Esta ferramenta molecular é importante, especialmente quando se suspeita que existem múltiplas infeções derivadas de diferentes agentes patogénicos, podendo a sua aplicação em aquacultura comercial revelar-se essencial.
- Development of a multiplex PCR tool for screening of pathogens in teleost farmed fishPublication . Pinto, Micaela Ferreira; Afonso, Clélia Paulete Correia Neves; Baptista, Teresa Maria CoelhoA aquacultura desempenha um papel cada vez mais importante na produção de alimentos em todo o mundo (Martins et al., 2015). Espécies dos géneros Aeromonas, Vibrio, Edwardsiella e Streptococcus são patógenos que infetam peixes (Zhang et al., 2014), causando elevadas perdas económicas em aquacultura. A corvina (Argyrosomus regius, Asso, 1801) é um dos maiores peixes da família Sciaenidae a nível mundial, e uma espécie de elevado valor comercial no Sudoeste da Europa, sendo neste momento objeto de grande interesse em todo o Mediterrâneo visando a sua produção comercial (Amoedo, 2011). Devido à sua elevada fertilidade, ampla distribuição e boa aceitação por parte dos consumidores torna-se um bom candidato à produção em aquacultura podendo atingir preços de mercado médio-altos (6 euros/kg, INE 2010). Como ainda não foram reportadas manifestações patológicas relevantes nesta espécie, o principal método de prevenção é o controlo da densidade nos tanques, sendo necessário pesquisar eventuais patógenos que afetem a corvina em diferentes estádios do seu ciclo e mesmo em condições de stress. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de uma ferramenta de multiplex- PCR para a deteção precoce de Edwardsiella tarda, Photobacterium damselae subsp. piscicida, Vibrio alginolyticus, Vibrio anguillarum e Vibrio harveyi em peixes de aquacultura, incluindo a corvina, que permita de forma prática e eficiente a deteção destes patógenos. Concluiu-se que é possível através de ferramentas de multiplex-PCR, a deteção dos patogénicos Edwardsiella tarda, Vibrio alginolyticus, Vibrio anguillarum e Vibrio harveyi até um limite mínimo de 0,4 ng de DNA/μl para V. anguillarum; 0.5 ng/μl para E. tarda; 1.5 ng/μl para V. harveyi e 5.6 ng/μl para V. alginolyticus, podendo, no futuro, estas técnicas ter aplicação prática cada vez mais extensa.
- Efeito da suplementação da dieta com Gracilaria gracilis na performance do crescimento, resposta imune e stress oxidativo de Sparus aurataPublication . Gomes, Emma Aline Fernandes Oliveira; Baptista, Teresa Maria Coelho; Afonso, Clélia Paulete Correia NevesCom o elevado crescimento do setor de aquacultura, o interesse no estudo da performance do crescimento de peixes e no fortalecimento do sistema imunológico, tem aumentado. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da adição de Gracilaria gracilis à ração de dourada, assim como avaliar o seu potencial de defesa num challenge bacteriano. Foram analisados os parâmetros de crescimento, parâmetros hematológicos, a performance imunológica (lisozima e peroxidase), as enzimas antioxidantes do stress oxidativo, parâmetros metabólicos plasmáticos e foi feita uma avaliação de alterações morfológicas dos intestinos. A dieta suplementada com 5% de G. gracilis moída, promoveu o crescimento, protegeu contra infeção por Photobacterium damselae subsp. piscicida e influenciou positivamente o perfil hematológico. Para além disso, não provocou alterações na morfologia do intestino, assim como não comprometeu a atividade das enzimas antioxidantes do stress oxidativo. Os peixes alimentados com a dieta suplementada com 5% de G. gracilis moída apresentaram contagem elevada de trombócitos, o que pode justificar a alta proteção contra a Photobacterium damselae subsp. piscicida, conferindo 95% de sobrevivência. A resposta imune não foi comprometida, tendo a dieta de extrato de alga a 0,15% apresentado uma maior concentração de lisozima. Em conclusão, a suplementação com alga moída foi capaz de melhorar a saúde dos peixes conferindo maior resistência bacteriana e melhor crescimento, o que permite considerar a G. gracilis um bom suplemento dietético para a aquacultura sustentável.
- Estudo da infeção de corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801) por Photobacterium damselae subsp. piscicidaPublication . Galhano, Fábio André Fernandes; Baptista, Teresa Maria Coelho; Cristóvão, Maria Manuel Machado Lopes Sampaio; Refojos, Benjamín CostasAs práticas intensivas que são utilizadas em aquacultura implicam que exista um contacto extremo entre indivíduos promovendo o stress, que atuando conjuntamente com diversos outros fatores, como é o caso de bactérias, são passíveis de induzir nos peixes um estado de doença. Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) é uma bactéria gram-negativa reconhecida por causar surtos graves de doença em diversas espécies de peixes. É considerada mundialmente como uma das maiores enfermidades para as práticas aquícolas, plausível de causar danos irreversíveis nestas populações. Neste trabalho pretendeu-se elaborar um protocolo de infeção com Phdp em Argyrosomus regius estabelecendo num primeiro ensaio a dose que causa mortalidade a 50% de uma população (LD50), estudando posteriormente num segundo ensaio, a infeção, o destino que a bactéria teria no peixe através de análise PCR, as consequências da infeção a nível hematológico e nos parâmetros imunitários, utilizando um modelo de coabitação, expondo indivíduos saudáveis a indivíduos doentes. Foi comprovada a virulência da estirpe AQP 17.1 de Phdp sobre indivíduos da espécie A. regius com um peso médio de 28,3±10,9g, situando-se o LD50 em 2,29×105 UFC ml-1, apresentando os peixes alguns sintomas típicos da doença crónica. O modelo de coabitação utilizado no segundo ensaio, permitiu-nos confirmar que Phdp infetou por coabitação indivíduos da espécie A. regius com peso médio de 23,4±8,6g. Os resultados sugerem que as brânquias podem ter sido um dos locais de entrada da bactéria no corpo do peixe, disseminando-se após 24 horas para o rim e intestino anterior. Phdp induziu em A. regius uma resposta imune inata que se avaliou ao longo do tempo quando comparados os indivíduos coabitantes do controlo (vetores injetados com tampão salino de Hanks) com os indivíduos coabitantes infetados (vetores injetados com suspensão de Phdp a uma concentração igual ao LD50). Esta resposta inflamatória ficou visível não só no aumento do número de leucócitos no sangue, mas também no aumento de atividade dos parâmetros humorais imunes. Os resultados sugerem que a maior atividade da resposta imunitária se deu após as 24 horas de coabitação, momento que determina também a invasão do patógeno em órgãos como o intestino anterior e o rim. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que Phdp pode induzir um estado de infeção em A. regius através de um modelo de coabitação, invadindo num curto espaço de tempo os órgãos do hospedeiro, desencadeando a atividade do sistema imune inato como resposta à infeção.
- Gracilaria gracilis as a novel source of food colorants: extraction optimization of phycobiliprotein pigmentsPublication . Pereira, Tatiana Filipa Martins; Silva, Maria Manuel Gil de Figueiredo Leitão e; Mendes, Susana Luísa da Custódia Machado; Baptista, Teresa Maria CoelhoOs corantes alimentares sintéticos têm sido utilizados na indústria alimentar durante séculos, mas hoje em dia com a mudança das tendências de consumo, existe uma grande procura por alternativas naturais com capacidade de substituir esses corantes. As ficobiliproteinas (PBPs) são proteínas solúveis em água presentes maioritariamente nas algas vermelhas e cianobactérias, com grande potencial económico nas indústrias farmacêuticas, biomédicas, alimentares e cosméticas. Estas proteínas podem ser classificadas em três grupos principais, baseados no seu comportamento de absorção: Ficoeritrinas (PE), Ficocianinas (PC) e Aloficocianinas (APC) com máximos de absorção entre os 540-570, 610-620 e 650-655 nm, respetivamente. Este trabalho tem como objetivo principal otimizar as condições de extração das PEs a partir da alga vermelha Gracilaria gracilis, presente na costa portuguesa que contém PBPs, principalmente PEs, como pigmentos acessórios, sendo uma alga principalmente utilizada como alimento e fonte de agar. Adicionalmente, foi estudado o efeito do pH e da temperatura na estabilidade dos extratos aquosos, bem como a sua aplicação em produtos alimentares. Foram estudadas cinco metodologias distintas, com elevado potencial em termos económicos e ambientais: maceração com almofariz, banho de ultrassons, sonicador, congelamento/descongelamento e altas pressões. As condições experimentais, tais como a concentração do tampão fosfato (C), o rácio solvente/biomassa (R), o tempo de homogeneização (t1), o tempo de extração (t2) e a pressão (P) foram otimizadas utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta (RSM). Esta permitiu delinear modelos sustentados nas variáveis independentes e explicar a variabilidade que ocorre nos parâmetros considerados significativos (rendimento). A maceração foi o método de extração mais eficiente (condições ótimas t1 = t2 = 10 min; C = 0,1 M; R = 1:50) atingindo valores de 3,583 ± 0,033 mg de PE/g de alga rendimentos 55-65 % superiores aos outros métodos testados. Quanto às condições, a variável t2 foi a que exerceu maior influência no rendimento obtido, enquanto o aumento de C resultou em menores rendimentos. t1 foi a avariável que menos efeito teve no resultado. Relativamente à estabilidade, foi monitorizado o efeito de diferentes temperaturas de armazenamento (-20, 4, temperatura ambiente (~19) e 40 ºC) e pH (4, 6,9 e 8) na concentração de PE durante 10 dias. Os resultados demonstram maior estabilidade a -20 ºC e pH 6,9. Como caso de estudo, o extrato purificado (pigmento) foi incorporado em panquecas (0,15 %) e iogurtes (0,12 %) como corante rosa. As PEs foram precipitadas com sulfato de amónio (65 %) e purificadas por diálise, permitindo a utilização em alimentos. Durante o processo de cozimento das panquecas, foi observada uma ligeira perda de cor, enquanto nos iogurtes a cor manteve-se praticamente inalterada durante mais de dois meses, sugerindo uma melhor aptidão deste tipo de produto para a coloração com PEs. Com este trabalho foi possível concluir que a Gracilaria gracilis tem potencial enquanto fonte de pigmentos para aplicações alimentares, especialmente para utilização em produtos que não necessitem de elevadas temperaturas no processo de produção.
- Ontogenia do sistema imunitário de corvina (Argyrosomus regius) a diferentes temperaturasPublication . Pires, Damiana Marques; Baptista, Teresa Maria Coelho; Soares, Florbela Maria BenjamimArgyrosomus regius é uma espécie emergente em aquacultura com conhecimento limitado do tempo de aparecimento e desenvolvimento de seu sistema imunológico durante o desenvolvimento ontogénico, o que é importante para prevenir surtos de doenças. Assim, o primeiro passo é determinar o aparecimento dos órgãos linfáticos, de modo a que possam ser aplicadas medidas profiláticas, para que os indivíduos adquiram resistência ao invés de tolerância. Este estudo avaliou o aparecimento de órgãos linfáticos em larvas de corvina cultivadas a duas temperaturas diferentes (15 ± 0,7 e 18 ± 0,5°C). As larvas foram obtidas a partir de reprodutores F1, mantidos na estação de Piloto de Piscicultura de Olhão (EPPO) pertencente ao IPMA (Instituto Português do Mar e Atmosfera). O cultivo larvar foi realizado em tanques cilíndrocónicos, em duplicados, com densidade inicial de 26 larvas L-1. O fotoperíodo foi de 14h-10h dia-noite e a renovação da água começou em 15%.h-1, aumentando para 40%.h-1 em sistema aberto. Também foi aplicado o método da água verde adicionando uma mistura de duas microalgas Nannochloropsis oculata (No) e Isochrysis galbana (Tiso). Dos 3 dias após a eclosão (DAE) até 10 DAE, as larvas foram alimentadas com rotíferos (Brachionus spp.). A artemia sp. foi fornecida desde 8 DAE e a alimentação inerte foi introduzida a 9 DAE. Ambos, rotíferos e Artémia, foram enriquecidos com RedPepper ® (Bernaqua TM) antes de serem fornecidos às larvas. A amostragem larvar foi realizada diariamente para biometria (comprimento total (mm) e peso seco (mg)) e histologia. Aos 20 DAE as larvas apresentaram maior comprimento total e peso seco (6,67±0,56mm; 0,56±0,06mg) no tratamento a 18°C em comparação com as larvas do tratamento a 15°C (4,77±0,38 mm; 0,12±0,04mg). Em relação ao aparecimento dos órgãos linfáticos, a sequência do seu aparecimento foi a seguinte: rim anterior (0 DAE), baço (6 DAE) e timo (8 DAE) para ambas as temperaturas. Assim, conclui-se que a temperatura não influenciou o aparecimento dos órgãos linfáticos, no entanto afetou o crescimento das larvas.
- Otimização e validação de protocolos para deteção e quantificação de VNN em peixes de aquaculturaPublication . Costa, João Nuno Agostinho Mateus da; Felício, Verónica Manuela Rôxo; Baptista, Teresa Maria CoelhoAs doenças no setor da aquacultura são um dos maiores problemas, causando enormes perdas económicas e na produção. As doenças virais são as que apresentam mais riscos, devido à sua capacidade de transmissão e ao facto de existirem poucos tratamentos ou medidas preventivas eficazes. O vírus da necrose nervosa (VNN) é um dos vírus mais preocupantes atualmente, pois afeta uma grande diversidade de peixes causando taxas de mortalidade próximas de 100%, especialmente nos estágios de larva e juvenil do ciclo de vida dos peixes. Atualmente, não existe um método de tratamento ou de controlo da infeção por VNN. Assim, é necessário o desenvolvimento de medidas que permitam diminuir as infeções por este vírus, como as técnicas de identificação e quantificação, que podem permitir evitar surtos maiores e, consequentemente, maiores perdas. Este estudo teve como objetivo a otimização de protocolos de identificação e quantificação de VNN, diversas matrizes, como o cérebro, larvas, ovos, rotíferos, artémia e vírus em suspensã