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- Desenvolvimento e validação de uma ferramenta molecular de multiplex-PCR para a deteção de Vibrio alginolyticus, Vibrio anguillarum e Vibrio harveyi em peixes de aquaculturaPublication . Ferreira, Ana Rita Carvalho; Afonso, Clélia Paulete Correia Neves; Baptista, Teresa Maria CoelhoO sector aquícola tem crescido largamente nos últimos anos, devido à procura crescente de alimento em todo o mundo e à diminuição dos recursos pesqueiros. Contudo, a presença de doenças infeciosas é uma constante ameaça podendo resultar em enormes perdas económicas neste setor. Algumas dessas doenças são causadas por bactérias, entre as quais se incluem espécies do género Vibrio. A criação de métodos de deteção prévia da presença destas bactérias em aquaculturas, como forma de prevenir potenciais surtos com consequências graves, é de uma importância extrema. O PCR é uma ferramenta molecular que permite a deteção rápida e específica destes agentes patogénicos, sendo utilizada neste tipo de situações com sucesso. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar uma ferramenta molecular de multiplex-PCR que permita a deteção precoce da presença de Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi e Vibrio alginolyticus, três dos agentes patogénicos que causam perdas avultadas em aquaculturas. As condições reacionais do multiplex PCR foram otimizadas de forma a estabelecer as condições de utilização desta ferramenta de forma eficaz, sensível e rigorosa. Foram utilizados 35 ciclos na amplificação, a temperatura de annealing ótima é de 58ºC e a concentração ideal de MgCl2 é de 7,5 mM. Os resultados indicam que a extração de ADN deve ser efetuada com kits apropriados, pois o método de fervura não se mostra suficientemente eficaz. Validou-se com sucesso a ferramenta em tecidos de linguados (Solea senegalensis) provenientes de aquacultura, tendo sido assim validada a utilização desta técnica na deteção precoce das espécies de Vibrio estudadas, em condições reais de uma aquacultura. Esta ferramenta molecular é importante, especialmente quando se suspeita que existem múltiplas infeções derivadas de diferentes agentes patogénicos, podendo a sua aplicação em aquacultura comercial revelar-se essencial.
- Flow-induced motions of flexible filaments hanging in cross-flowPublication . Silva-Leon, Jorge; Cioncolini, Andrea; Filippone, Antonio; Domingos, MarcoExperiments were carried out to study the dynamics of hanging cantilever flexible filaments in air cross-flow. Thirteen flexible filaments of 0.61 mm diameter and lengths from 20 mm to 60 mm were tested with wind speeds in the range of 1–15 m/s, corresponding to Reynolds numbers of 25 < Red < 610 and reduced velocities in the range of 5 < U∗ < 130. Two synchronized fast-imaging cameras were used to reconstruct the motion of the filaments in three dimensions, and a blend of linear and nonlinear time-series analysis techniques was used to analyze the observed dynamics. Long filaments show a rich dynamics as the wind speed is gradually increased, ranging from small amplitude vibration to large amplitude limit-cycle oscillation and to a more complex chaotic motion. However, short filaments only exhibit a small amplitude vibration-like motion throughout the range of wind speeds tested. Turbulent buffeting is identified as the main source of excitation responsible for the observed filaments dynamics. The results highlight the importance of the filament damping ratio, which is modulated by the filament length, as a controlling parameter for the dynamics of flexible filaments in cross flow, in addition to the flow velocity. The Scruton number for these tests correspond to 31 < Sc < 86.
- Is it possible to detect Betanodavirus with non-lethal sampling methods in experimentally infected Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758)?Publication . Ferreira, Inês de Almeida; Baptista, Teresa Maria Coelho; Thompson, Kimberly; Costa, JaninaAtualmente, uma das principais preocupações com a indústria aquícola está relacionada com os surtos de Encefalopatia e Retinopatia Viral (ERV), uma vez que esta doença está associada a níveis elevados de mortalidade (até 90-100% de mortalidade), especialmente em peixes juvenis. Mais de 120 espécies cultivadas e selvagens são suscetíveis a esta patologia. O agente etiológico desta patologia é designado por Betanodavirus, um vírus constituído por duas cadeias simples de RNA sem envelope (ssRNA). Recentemente, a técnica de RT-PCR em tempo real tem vindo a adquirir mais importância, como método confiável para deteção de Betanodavirus. O órgão preferencial para detetar Betanodavirus é o cérebro, porém, para analisar reprodutores, este método de amostragem letal não é adequado. Os métodos de amostragem não-letal, como utilização de barbatanas, brânquias ou serologia, têm sido investigados numa sociedade cada vez mais preocupada com o bem-estar animal. O objetivo deste estudo consistiu em avaliar a viabilidade destes tecidos para a deteção de uma infeção de Betanodavirus em robalo legítimo (Dicentrarchus labrax). Foram analisados quatro tecidos distintos, o cérebro (órgão preferencial para deteção de Betanodavirus), brânquias, barbatana caudal e sangue como tecidos provenientes de amostragem não-letal para avaliar a sua adequabilidade ao método de deteção RT-PCR em tempo real. Juvenis de robalo foram infetados com o vírus por injeção intramuscular ou imersão, e amostras de tecido, sangue e serum foram recolhidas nos dias 7, 15 e 30 após infeção experimental. O método ELISA permitiu a deteção de anticorpos específicos para Betanodavirus aos 7 dias após a infeção experimental. Concentrações mais elevadas de anticorpos foram detetadas nos dias 15 e 30 após infeção experimental, para ambos os métodos de infeção. A presença de anticorpos indica que este é um método adequado para avaliar o estado serológico dos peixes em estágios de infeção precoces até pelo menos um mês após infeção. Foi possível detetar o RNA viral em todos os tecidos analisados com RT-PCR em tempo real. A carga viral presente nos tecidos provenientes de amostragem não letal foi sempre mais reduzida do que a apresentada pelo cérebro em todos os dias de amostragem. Vírus foi detetado nos tecidos de amostragem não letal a partir do dia 7 após infeção experimental. A carga viral na barbatana caudal apresentou diferenças estatisticamente significativas entre dias de amostragem, enquanto que as brânquias apresentaram diferenças entre tratamentos e dias de amostragem. Como esperado, o cérebro foi o único tecido que registou a presença do vírus independentemente do método de infeção ou do dia de amostragem. A presença de vírus ao longo do período de amostragem não foi constante nos tecidos de amostragem não letal (brânquias, barbatana caudal e sangue) e a carga viral foi sempre mais reduzida dos que a registada para o cérebro. Cargas virais elevadas foram detetadas no sangue de peixes infetados por injeção intramuscular desde dia 15 até ao final do ensaio. A presença do vírus detetada em todos os dias de amostragem e em quantidade mais elevada, e o reconhecido tropismo deste vírus para tecidos do sistema nervoso, permitem aconselhar que o cérebro permaneça como órgão preferencial para o diagnóstico e triagem de peixes infetados com Betanodavirus. Porém, os resultados apontam para o facto de que são necessários mais estudos sobre o uso destes tecidos de amostragem não letal de forma aceitar ou rejeitar, sem dúvidas, a possibilidade de utilizar estes tecidos no diagnóstico de uma infeção em peixes por Betanodavirus.