Mestrados da ESTM
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Browsing Mestrados da ESTM by Field of Science and Technology (FOS) "Ciências Naturais::Ciências Biológicas"
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- Atividade citotóxica do diterpeno eleganolone isolado da macroalga Bifurcaria bifurcataPublication . Pingo, Mónica Filipa Bastos; Silva, Joana; Alves, Celso; Pedrosa, RuiAtualmente, o cancro representa uma das grandes ameaças para a saúde humana, sendo classificada como a segunda causa de morte a nível mundial, pelo que é necessário encontrar e desenvolver alternativas inovadoras para os regimes terapêuticos atualmente utilizados. Os efeitos secundários assim como a resistência evidenciada por alguns tipos de cancro às terapêuticas atuais, têm conduzido a uma procura crescente por soluções inovadoras. Nesta perspetiva, o ambiente marinho tem-se revelado uma fonte de novas moléculas, com estruturas químicas e mecanismos de ação inovadores. Assim, a presente dissertação teve como principal objetivo avaliar a atividade citotóxica do diterpeno eleganolone isolado da macroalga castanha Bifurcaria bifurcata, em diferentes linha celulares de origem maligna, entre eles o melanoma (SK-MEL-28), carcinoma da próstata (DU-145) e adenocarcinoma da mama (MCF-7). O eleganolone foi isolado com recurso a meios cromatográficos (cromatografia líquida de alta eficiência) e a sua identificação foi realizada pela técnica de ressonância magnética nuclear de protão. A citotoxicidade do composto (1 – 100 μM; 24 h) foi avaliada através dos métodos de MTT e da Calceína-AM e pela quantificação da enzima lactato desidrogenase (LDH). De forma a entender as vias de sinalização inerentes à citotoxicidade verificada, vários biomarcadores celulares foram estudados, nomeadamente a quantificação de espécies reativas de oxigénio (ERO) (10 – 100 μM; 6, 12 e 24 h), alterações do potencial da membrana mitocondrial (10 – 100 μM; 6, 12 e 24 h), a atividade da Caspase-9 (10 – 100 μM; 12 e 24 h) e as alterações morfológicas do ADN (10 – 100 μM; 12, 24, 48 e 72 h). A partir de uma fração do extrato de diclorometano da macroalga B. bifurcata, foi possível isolar o eleganolone. Para verificar a existência de seletividade por parte do composto foi avaliado o valor de IC50 relativo a cada linha celular, sendo estas expostas a cinco concentrações de eleganolone (1 – 100 μM), durante 24 horas. Os valores apresentados variaram entre 20,65 μM e >100 μM, sendo o menor valor registado na linha celular MCF-7 (20,65 μM), seguida da linha celular SK-MEL-28 (90,82 μM) e da linha celular DU-145 (>100 μM). O tratamento com eleganolone resultou num aumento do nível de espécies reativas de oxigénio, induziu mudanças no potencial de membrana da mitocôndria, aumentou a atividade da Caspase-9 e promoveu a condensação e/ou fragmentação do ADN. viii Em suma, o eleganolone apresenta atividade citotóxica contra as células do cancro da mama (MCF-7) e do melanoma (SK-MEL-28), e o seu efeito pode estar associado a estimulação de uma situação de stress oxidativo e consequente morte celular por apoptose. Apesar dos resultados aqui apresentados serem um forte indicativo do envolvimento destas vias de sinalização intracelulares, trata-se apenas de uma investigação inicial, pelo que são necessários mais estudos para confirmar o seu potencial terapêutico na área do cancro.
- Avaliação do potencial dos extratos das macroalgas Codium tomentosum e Gracilaria gracilis como bioestimulantesPublication . Ferreira, Carolina Andreia dos Santos; Afonso, Clélia Paulete Correia NevesAs macroalgas são organismos fotossintéticos, muito diversificados. A espécie Gracilaria gracilis, bem como o Codium tomentosum, são comestíveis e apresentam compostos bioativos de elevado interesse, com diversas aplicações em diferentes áreas (alimentar, cosmética, entre outras). Embora não sejam atualmente utilizadas de forma ampla na agricultura, as macroalgas são usadas há já muito anos como bioestimulantes de plantas. Recentemente, ressurgiu um novo interesse nas aplicações agrícolas das macroalgas, relacionado com a procura crescente de produtos que não prejudicam o ambiente e que tornam a produção vegetal mais rentável e sustentável. As macroalgas apresentam na sua constituição, polissacarídeos e hormonas vegetais, (tais como as auxinas, as citocininas, o etileno, as giberelinas e o ácido abscísico), substâncias conhecidas por desempenharem um papel relevante no desenvolvimento e fisiologia das plantas. São também ricas em proteínas, fibras, vitaminas e minerais. O principal objetivo deste trabalho foi a determinação do potencial bioestimulante de extratos de macroalgas, com especial ênfase no seu efeito sobre a germinação e o crescimento de plantas. Adicionalmente, foi testado o potencial aumento da resistência ao stress térmico e ao stress salino. O efeito bioestimulante foi testado em duas espécies agrícolas: alface (Lactuca sativa L.) e tomate (Solanum lycopersicum L.). Foi possível concluir que, na maioria dos ensaios, as sementes expostas aos extratos de macroalgas das espécies testadas (Gracilaria gracilis ou Codium tomentosum) apresentam uma germinação mais acelerada do que o controlo, traduzida por uma percentagem de germinação mais elevada, em cada dia, apresentando, ainda, um desenvolvimento superior das radículas e dos hipocótilos N, bem como uma percentagem de humidade mais elevada. Foi, ainda, possível constatar que as sementes expostas aos extratos de Gracilaria gracilis e de Codium tomentosum apresentam uma maior resistência ao stress salino e ao stress térmico.
- Biomassa de algas vermelhas: caracterização química e bioatividadesPublication . Inácio, Leonardo Daniel Garcia; Mouga, Teresa Margarida Lopes da SilvaO ambiente marinho apresenta uma grande diversidade de organismos e condições abióticas. Dentro dos organismos marinhos com maior distribuição e diversidade, encontram-se as algas. Estas apresentam diversas características que as tornam interessantes do ponto de vista económico, sendo tradicionalmente utilizadas como alimento, incorporadas em ração para animais e fertilizante. Estes usos tradicionais despertaram o interesse da comunidade científica que, cada vez mais se dedica ao estudo destes organismos. Dentro das algas, as algas vermelhas (Rhodophyta) apresentam um grande número de espécies e estão presentes em diversos tipos de ecossistemas sobretudo marinhos, sendo conhecidas por produzirem ficobiliproteínas responsáveis pela sua cor avermelhada. Dentro das Rhodophyta, o Sphaerococcus coronopifolius (ordem Gigartinales) e a Jania rubens (ordem Corallinales) são duas algas muito abundantes na costa portuguesa, cujo conhecimento é, ainda, relativamente limitado. Quanto à caracterização do seu perfil nutricional, o S. coronopifolius apresentou maior teor de humidade, proteína, matéria gorda e hidratos de carbono, e a J. rubens apresentou o maior conteúdo de cinzas, 79,79% peso seco (DW), em parte devido ao seu revestimento calcário. Neste campo é de destacar o baixo conteúdo em matéria gorda apresentado pelas duas espécies, assim como o elevado conteúdo em hidratos de carbono, 40,23 % DW do Sphaerococcus coronopifolius. Relativamente aos pigmentos, o S. coronopifolius, em geral, apresentou maior conteúdo em ficobilinas, sendo o melhor processo/solvente de extração variável consoante a espécie. Já no caso da clorofila a e dos carotenoides, o destaque positivo vai para a Jania rubens. Ambas as espécies apresentam diferentes rendimentos de extração para cada solvente, sendo que a extração aquosa apresentou o maior rendimento nos dois casos. Ao analisar as bioatividades dos extratos aquosos verificou-se um maior potencial de redução do radical DPPH pelo extrato de S. coronopifolius, contudo, o grande destaque vai para a Jania rubens com 99,65 % de inibição do radical ABTS. Já nos polifenóis totais, o estrato aquoso do S. coronopifolius apresentou maior quantidade (0,67 mg GAE.g−1). Foi detetado potencial antimicrobiano contra B. subtilis, no entanto, não houve atividade contra E. coli nem S. cerevisiae, para nenhuma das duas espécies. Os resultados conseguidos neste trabalho permitem melhorar o conhecimento destas espécies que ainda é escasso, especialmente quanto ao perfil nutricional. Pode ainda despertar o interesse de estudos mais aprofundados, e interesse industrial na aplicação destas espécies na área alimentar e farmacêutica.
- Desenvolvimento e validação de uma ferramenta molecular de multiplex-PCR para a deteção de Vibrio alginolyticus, Vibrio anguillarum e Vibrio harveyi em peixes de aquaculturaPublication . Ferreira, Ana Rita Carvalho; Afonso, Clélia Paulete Correia Neves; Baptista, Teresa Maria CoelhoO sector aquícola tem crescido largamente nos últimos anos, devido à procura crescente de alimento em todo o mundo e à diminuição dos recursos pesqueiros. Contudo, a presença de doenças infeciosas é uma constante ameaça podendo resultar em enormes perdas económicas neste setor. Algumas dessas doenças são causadas por bactérias, entre as quais se incluem espécies do género Vibrio. A criação de métodos de deteção prévia da presença destas bactérias em aquaculturas, como forma de prevenir potenciais surtos com consequências graves, é de uma importância extrema. O PCR é uma ferramenta molecular que permite a deteção rápida e específica destes agentes patogénicos, sendo utilizada neste tipo de situações com sucesso. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar uma ferramenta molecular de multiplex-PCR que permita a deteção precoce da presença de Vibrio anguillarum, Vibrio harveyi e Vibrio alginolyticus, três dos agentes patogénicos que causam perdas avultadas em aquaculturas. As condições reacionais do multiplex PCR foram otimizadas de forma a estabelecer as condições de utilização desta ferramenta de forma eficaz, sensível e rigorosa. Foram utilizados 35 ciclos na amplificação, a temperatura de annealing ótima é de 58ºC e a concentração ideal de MgCl2 é de 7,5 mM. Os resultados indicam que a extração de ADN deve ser efetuada com kits apropriados, pois o método de fervura não se mostra suficientemente eficaz. Validou-se com sucesso a ferramenta em tecidos de linguados (Solea senegalensis) provenientes de aquacultura, tendo sido assim validada a utilização desta técnica na deteção precoce das espécies de Vibrio estudadas, em condições reais de uma aquacultura. Esta ferramenta molecular é importante, especialmente quando se suspeita que existem múltiplas infeções derivadas de diferentes agentes patogénicos, podendo a sua aplicação em aquacultura comercial revelar-se essencial.
- Fucoidan extracted from brown seaweed Bifurcaria bifurcata: seasonal variations on physicochemical features and anti-tumor activity against breast cancer cell linePublication . Inácio, Ana Rita Matos; Silva, Tiago Henriques da; Afonso, Clélia Paulete Correia NevesRecentemente, a humanidade tem sondado os oceanos na procura de fontes naturais de compostos bioativos, entre os quais os polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas têm recebido particular atenção devido às diversas propriedades muito interessantes que têm sido descritas. A alga castanha Bifurcaria bifurcata é uma alga comestível atualmente pouco estudada e foi utilizada neste trabalho como fonte para a extração de um polissacarídeo sulfatado, a fucoidana, através do método de extração de água. Este estudo explora a variação sazonal da alga B. bifurcata recolhida mensalmente na praia de Aver-o-Mar, Póvoa-de-Varzim, em comparação com a alga produzida em cultivo. A extração de fucoidana foi possível com rendimentos de 1.06% a 2.48%, dependendo da altura do ano em que as algas foram recolhidas. Os resultados de FTIR e RMN são compatíveis com a identificação do polissacarídeo extraído como fucoidana, uma vez que possui as características descritas na literatura, como a presença de fucose e sulfato. Através da análise de monossacarídeos e sulfato, que confirmaram os resultados obtidos por FTIR e RMN, verificámos que o açúcar dominante era a fucose (20.55-71.40%), em todos os extratos, e que existia a presença de sulfatos (3.54-23.93%), duas características típicas da fucoidana. Foi também possível observar a variabilidade das propriedades físico-químicas da fucoidana extraída com o mês de recolha das algas. De acordo com os resultados do teor de proteína (3.39-24.88%) pudemos verificar que os extratos não eram puros, sendo necessário um procedimento de purificação mais eficiente e/ou um melhoramento no pré-tratamento dado às algas. Adicionalmente, o estudo do desempenho biológico como agente citotóxico para linha celular de cancro da mama demonstrou que os extratos não possuiam o mesmo comportamento, sendo que apenas alguns pareciam evidenciar atividade anti-tumoral. Comprovou-se a variação sazonal das algas castanhas no que diz respeito às propriedades da fucoidana extraída. Este conhecimento é fundamental quando se consideram aplicações industriais deste polissacarídeo, para identificar tempos ótimos de colheita e garantir uma composição consistente do produto. Em geral, os resultados obtidos suportam a utilização da alga B. bifurcata para a extração de fucoidana para posterior utilização biotecnológica.
- Identification and analysis of novel virulence-defective Rhodococcus fascians mutantsPublication . Cabecinhas, Adriana Sofia Silva; Vereecke, Danny; Rodrigues, Américo do PatrocínioRhodococcus fascians é uma actinomiceta fitopatogénica que induz uma doença, conhecida como irritação frondosa, caracterizada pela indução de múltiplos rebentos, numa vasta gama de plantas herbáceas dicotiledóneas. O principal factor de patogenicidade da bactéria é a produção de uma mistura de 6 citoquininas codificadas pelos genes do operão fas que está localizado num plasmídeo linear associado à virulência, pFiD188. Este trabalho teve como objectivo a análise de dois novos loci deste plasmídeo associados à virulência: GT1 que codifica uma glicosiltransferase e os genes mtr1 e mtr2, grandemente homólogos, que codificam metiltransferases dependentes de SAM. Trabalhos prévios com 21D5, mutante na glicosiltransferase, mostraram que possui uma morfologia de colónia modificada e forma agregados em culturas líquidas. Neste trabalho demonstrou-se que essas características não afectam o crescimento em meio de cultura rico, mas levam à incapacidade de proliferação em condições de privação de nutrientes, tendo um impacto forte na competência epifítica. Este impacto foi demostrado pela atenuação severa da virulência em 21D5, que foi acompanhada de uma expressão alterada dos genes fas e att, essenciais para a virulência, e consequente redução da capacidade de invasão dos tecidos da planta e de produção dos factores de virulência. Demonstrou-se também que a expressão de GT1 é induzida por compostos que são acumulados em plantas nas fases iniciais da infecção, colocando a função de GT1 no começo da interacção. Tal como R. fascians, Streptomyces turgidiscabies possui um operão fas e dois genes mtr associados. R. fascians mutantes nestes genes mtr’s perderam a capacidade de provocar sintomas, mas produziram 2MeS-citoquininas, implicando que outras citoquininas metiladas são cruciais para a indução da doença. De modo a identificar os produtos de reacção das MTRs procedeu-se à análise do perfil de citoquininas de R. fascians em condições que induzem a expressão dos genes do operão fas e de S. turgidiscabies alimentados com SAM e adenina marcadas com 14C em TLC. No entanto, não foi possível a identificação de compostos dependentes de fas ou mtr nos sobrenadantes. Pela determinação do perfil de expressão dos genes mtr in vitro e in planta tornou-se claro que a regulação destes genes é muito complexa, sendo a sua expressão limitada a células de R. fascians que colonizam o hospedeiro. Para possibilitar a identificação dos produtos de recção de MTR, desenvolveu-se um protocolo que permite a expressão in planta em condições in vitro, o que permitirá a repetição dos ensaios de marcação com 14C.
- Modelling Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) reproduction through nutrition and temperaturePublication . Santos, Patrícia Alexandra Matos; Lourenço, Silvia Alexandra PereiraThe sea urchin Paracentrotus lividus is highly appreciated in Europe for its gonads. The reddish-orange pigmentation of the gonads is the result of the accumulation of echinenone, a carotenoid pigment, resulting of the transformation, in the digestive tube, of dietary β-carotene present in a variety of algae which P. lividus feeds on. These carotenoids play a significant role in various biological functions of sea urchins, including oocyte production and development. Temperature has also been shown to influence the progression of sea urchins through their developmental stages and elevated temperatures have been demonstrated to exert a considerable degree of stress on the animals. The present study was conducted following the hypothesis that a diet abundant in carotenoids will have a beneficial effect on the reproduction and early development of sea urchins. The principal objective of this study was to evaluate the combined effect of different temperatures and diets on the maturity, oocyte size and embryonic development of P. lividus. To achieve such objective, adult sea urchins were subjected to a maturity enhancement trial of 120 days, where these were fed two jellified diets, one rich in carotenoids (HC) and the other without (LC). During the trial, the sea urchins were conditioned to two different temperatures, an ambient temperature (18ºC) and an ocean warming scenario (21.5ºC), in a crossed design with four conditioning treatments (18LC, 18HC, 21LC and 21HC). After this trial, the females from each treatment were induced to spawn, crossing their oocytes with the males from the 18HC treatment. The resulting eggs were then incubated for 48 hours at the same temperature as the females. The results obtained demonstrated a general increase in the gonadosomatic index in all treatments. Histological analysis showed that males had a higher percentage of maturation regardless of the conditioning treatment. Furthermore, the oocytes from the 18LC females were found to be larger than those produced by females from the remaining treatments. The embryos obtained from females of the 21HC treatment demonstrated accelerated development, with malformations affecting the position/shape of the spicules. The study concluded that all four treatments promoted maturation, partially supporting the initial hypothesis. It was also concluded that temperature at which the progeny is kept can have a greater influence on malformations than the diet consumed by the progeny, not supporting the initial hypothesis proposed.
- Relatório de Estágio para obtenção do Grau de Mestre em AquaculturaPublication . Martins, Mariana Ribeiro Cristino Roque; Baptista, Teresa Maria Coelho; Serradeiro, RenataA aquacultura tem vindo a adquirir uma crescente importância mundial, de modo a compensar a progressiva redução das populações naturais de diversas espécies, bem como a necessidade de produção de recursos que satisfaçam as necessidades alimentares da população humana, consequência do aumento exponencial da mesma. A empresa Riasearch, pioneira em Portugal, dedica-se fundamentalmente à investigação aplicada e desenvolvimento experimental na área da aquacultura, através da realização de ensaios nutricionais, fornecendo um serviço inovador para o setor da aquacultura. Tem como principal objetivo a validação de dietas destinadas a diferentes organismos aquáticos, através da realização de ensaios de digestibilidade e crescimento destes mesmos organismos. O estágio curricular na empresa teve como principal objetivo o contacto com a realidade empresarial na área da aquacultura, integrando as mais diversas rotinas da instalação. A Riasearch pretende implementar um sistema de aquacultura multitrófica integrada (IMTA), associando o seu sistema de recirculação de água (RAS) a um sistema inovador de cultivo de holotúrias, tendo optado por escolher uma espécie, Holothuria forskali, com potencial para desempenhar um papel importante na economia da própria empresa e das empresas aquícolas nacionais. Ainda pouco se sabe sobre quais as dietas artificiais capazes de induzir um rápido crescimento, suprir as exigências nutricionais e obter um crescimento proporcionado e saudável das holotúrias, garantindo resultados na produção de pepinos-do-mar comercialmente importantes. O presente estudo teve como principal objetivo verificar se os produtos derivados de um efluente proveniente de camarões da espécie, Litopenaeus vannamei, constituído essencialmente por fezes e alimento não consumido (Tratamento 1), é uma dieta viável para a espécie Holothuria forskali, capaz de substituir uma dieta à base de uma conjugação de três microalgas Isochrysis galbana, Tetraselmis sp. e Phaeodactylum triconutum (Tratamento 2), em termos de crescimento, sobrevivência e valor nutricional. Os resultados sugerem que a inclusão alimentar deste efluente, proporciona o crescimento das holotúrias, com valores para a taxa de crescimento específico (SGR) de 0,37 ± 0,26%/dia e 0,62 ± 0,05%/dia para as microalgas. Foram obtidas taxas de sobrevivência de 52% em ambos os tratamentos, em aproximadamente 6 semanas. No que diz respeito ao valor nutricional, esta dieta ainda é deficitária, comparativamente ao perfil de ácidos gordos das holotúrias selvagens, que apresentam valores mais elevados destes mesmos ácidos gordos, mais importantes para a nutrição e saúde humana.