ESTM - Mestrado em Biotecnologia dos Recursos Marinhos
Permanent URI for this collection
Browse
Browsing ESTM - Mestrado em Biotecnologia dos Recursos Marinhos by advisor "Alves, Celso Miguel da Maia"
Now showing 1 - 10 of 10
Results Per Page
Sort Options
- Adding value to the seaweeds Codium sp. and Gelidium corneumPublication . Matias, Margarida Moreira Fernandes; Alves, Celso Miguel da Maia; Pedrosa, Rui Filipe Pinto; Martins, Alice Isabel MendesA indústria cosmética é um dos principais focos de desenvolvimento económico no século XXI, ao mesmo tempo que a exigência de sustentabilidade por parte dos consumidores está a impulsionar a procura de novos ingredientes naturais ativos. Neste âmbito, o objetivo desta dissertação foi avaliar o potencial cosmético de duas macroalgas, elidium corneum e Codium sp. Os extratos hidroalcoólicos destas macroalgas foram submetidos a uma separação líquido-líquido, obtendo-se cinco frações (F1 - F5) as quais foram analisadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (1H NMR). Recorreu-se a diversos ensaios in vitro para avaliar as seguintes bioatividades: i) antioxidante (quantificação total de compostos fenólicos (TPC), redução do radical 2,2-difenil-1- picrilhidrazilo (DPPH), capacidade de redução do Fe (III) (FRAP) e capacidade de absorção dos radicais livres de oxigénio (ORAC); ii) citotóxica, através do método 3-(4,5-dimetriazol- 2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT) em células HaCaT e RAW 264.7; iii) fotoprotetora, quantificando as espécies reativas de oxigénio (ROS) após exposição aos UVA-B, e cicatrizante, através da medição de área cicatrizada em células HaCaT; iv) inflamatória em células RAW 264.7, medindo a produção de óxido nítrico (NO); v) antimicrobiana, contra Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Cutibacterium acnes. G. corneum foi a alga selecionada para preparar duas formulações cosméticas. A estabilidade das emulsões foi avaliada através de microscopia ótica, análise do tamanho das gotas, teste de centrifugação e análise reológica. Os maiores rendimentos de extração foram obtidos com os extratos brutos de ambas as algas (45% e 24% para Codium sp. e G. corneum, respetivamente). Os espetros de 1H NMR mostraram sinais típicos de compostos lipofílicos nos extratos brutos (F1), insolúveis em água (F2) e éter dietílico (F3). Sinais caraterísticos de compostos mais polares foram visíveis nas frações de acetato de etilo (F4) e aquosas (F5). A melhor capacidade antioxidante foi demonstrada pelas frações F3 e F4 de G. corneum, tendo F3 a maior capacidade de redução do radical DPPH (EC50: 399,6 !g/mL) e o maior potencial no ensaio FRAP (49,0 ± 5,3 !M FeSO4/g de extrato). A fração F4 obteve o melhor desempenho no ensaio ORAC (3060,0 ± 222,2 !moL T/g de extrato), bem como o maior teor de fenólicos totais (32,9 ± 6,3 mg GA/g de extrato). O extrato bruto (F1) de Codium. sp. promoveu a maior redução dos níveis de ROS (33,5 ± 7,1%), seguido de F1 (27,5 ± 5,8%) de G. corneum. Quanto à capacidade de cicatrização, F2 de G. corneum evidenciou o melhor potencial, com 76,8 ± 10,0% de área sarada em 12 h, seguido de F5 de Codium sp. (73,3 ± 7,2%). Excetuando esta última, nenhuma das frações estimulou a produção de NO nas células RAW 264.7, sugerindo que não causam irritação cutânea. Quanto ao potencial antimicrobiano, a fração F2 de G. corneum inibiu significativamente o crescimento de C. acnes e S. epidermidis (IC50 de 16,1, e 53,3 !g/mL, respetivamente); Codium sp. F3 e F2 foram as mais eficazes contra o crescimento de C. acnes (IC50 de 51,2 e 67,7 !g/mL, respetivamente). Este efeito parece estar relacionado com a hiperpolarização da membrana citoplasmática. Como prova de conceito, a fração F5 de G. corneum foi incluída numa emulsão hidratante e a sua biomassa residual num hidrogel esfoliante. A emulsão com extrato a 1% mostrou estabilidade nos ensaios preliminares. Os resultados sugerem que ambas as macroalgas devem ser exploradas como fontes de ingredientes bioativos com propriedades diversas para uso cutâneo.
- Atividade anti-inflamatória e anti-viral de bromoditerpenos isolados da alga Sphaerococcus coronopifoliusPublication . Perez, Erick Alejandro Villegas; Alves, Celso Miguel da MaiaA inflamação é uma resposta inata para manter a homeostasia do organismo, atuando como mecanismo de defesa contra diversos fatores, incluindo patógenos, células danificadas e compostos tóxicos. Contudo, quando essa reação é demasiado prolongada, pode causar problemas ao nível dos tecidos e órgãos, inclusive conduzir à morte. A COVID-19 é uma doença infeciosa causada pelo vírus SARS-CoV-2, do grupo dos coronavírus, que, frequentemente, se manifesta com sintomas de infeção respiratória aguda, com grande impacto na saúde e nas economias globais. O desenvolvimento de medicamentos neste contexto é complexo e vai desde a compreensão do mecanismo de ação até à avaliação da sua eficácia e toxicidade. Como tal, o desenvolvimento de agentes terapêuticos contra o vírus SARS-CoV-2, que mitiguem alguns efeitos da doença como a inflamação severa, é uma necessidade, já que a terapia convencional tem limitações, incluindo a possível redução da eficácia das vacinas contra as variantes com mutações em genes-chave. Neste contexto, os organismos marinhos constituem fontes excecionais de novas moléculas com potencial terapêutico, como os bromoditerpenos presentes na alga vermelha Sphaerococcus coronopifolius, os quais já demonstraram atividades anticancerígenas, antifouling e antimicrobianas. Contudo a sua capacidade anti-inflamatória ainda permanece desconhecida. Utilizando técnicas de cromatografia em coluna preparativa (CC) e semipreparativa (HPLC) foi possível isolar quatro compostos desta alga. Através de análise por ressonância magnética nuclear de protão (1H RMN) foi possível identificar o sesquiterpeno Aloaromadendreno, e três bromoditerpenos, Sphaerococcenol A, Bromosphaerol e 12Rhidroxi-bromosphaerol. Para avaliar o potencial anti-inflamatório destes compostos, foi previamente realizado um teste de citotoxicidade em macrófagos RAW 264.7 (0,01 – 10 μM; 24 h) para definição das concentrações sub-tóxicas. Nenhum dos compostos estimulou a produção de óxido nítrico (NO). Nos macrófagos RAW 264.7 tratados com lipopolissacarídeos (LPS), o Aloaromadendreno (1 μM) reduziu significativamente a produção de NO de 171,5 ± 8,9% para 111,0 ± 4,8%. Por sua vez, o Bromosphaerol (10 μM) foi o composto que exibiu a maior redução da concentração do fator de necrose tumoral (TNF-α) (637,5 ± 192 pg/mL) comparado com o tratamento com LPS (1209,0 ± 84,6 pg/mL). No que diz respeito, à interleucina-6 (IL-6), o Sphaerococcenol A (0,1 μM) reduziu significativamente os seus níveis (129,3 ± 31,3 pg/mL), quando comparado com o tratamento com LPS (862,7±39,9 pg/mL). Finalmente, o composto 12R-hidroxi-bromosphaerol (1μM) foi o único que demonstrou estimular significativamente a produção da citocina anti-inflamatória interleucina-10 (1301.0 ± 381,1 pg/mL). No que diz respeito à atividade antiviral, foi realizado um ensaio dinâmico in-silico, com recurso à ferramenta informática Dockthor, utilizando as estruturas (PDB:6LU7) da Mpro, proteína essencial no processo de replicação do SARS-COV-2 , (PDB: 6M0J) da Spike, e (PDB:1O9K), proteína essencial na entrada do vírus na células hospedeira, e da pRb, proteína essencial na eliminação da propagação de células cancerígenas O composto 12R-hidroxi-bromosphaerol demonstrou a maior afinidade, assim como estabilidade nas ligações com a proteína Mpro, com uma energia de afinidade de -8.1 (kcal/mol) e uma interação hidrofóbica com Cys145 (distância 5,35 Å). Por sua vez, o Bromosphaerol exibiu interação com a proteína Spike, apresentando uma energia de afinidade de -7.9 (kcal/mol). Relativamente à proteína pRb, o composto 12R-hidroxi-bromosphaerol foi o que exibiu uma maior interação com uma energia de -8.4 (kcal/mol). No entanto o Sphaerococcenol A foi o único composto que interagiu com o sítio ativo da pRb, mediante uma ponte de hidrogénio com Arg467 (distância 2,58 Å). Em suma, os compostos da alga vermelha Sphaerococcus coronopifolius, demonstram capacidade de mediar efeitos em diferentes biomarcadores relacionados com o processo inflamatório, assim como interagir com diferentes proteínas relevantes no processo de infeção do SARS-CoV2. Como tal, estes compostos poderão contribuir para inspirar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para tratamento de doenças virais, com SARS-CoV2.
- Dermocosmetic potential of the macroalgae Fucus spiralisPublication . Freitas, Rafaela Patrícia Freire; Pedrosa, Rui Filipe Pinto; Alves, Celso Miguel da Maia; Martins, Alice Isabel MendesA pele é o maior órgão do corpo humano estando sujeita a fatores intrínsecos e extrínsecos que influenciam negativamente a sua homeostasia, particularmente a exposição à radiação ultravioleta. A contínua exposição da pele a agentes nocivos pode despoletar o stress oxidativo que está associado não só ao envelhecimento cutâneo, mas também ao desenvolvimento de patologias dérmicas mais severas, sendo de extrema importância o seu cuidado e proteção. Com a progressiva consciencialização dos consumidores sobre a importância da pele e o impacto de alguns ingredientes sintéticos na saúde, existe uma procura crescente por formulações de origem natural. Neste contexto, o objetivo da presente dissertação consistiu na avaliação do potencial cosmético de onze frações obtidas da alga Fucus spiralis. As frações foram obtidas através de três metodologias de extração distintas, usando diferentes solventes permitidos na área cosmética, tempos e temperaturas de extração. O potencial mocosmético das frações foi determinado através da avaliação das suas propriedades antioxidantes (quantificação total de polifenóis, capacidade de redução do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH), capacidade de redução do ião ferro (III) (FRAP), e capacidade de absorção dos radicais de oxigénio (ORAC)), da capacidade de inibir enzimas envolvidas no envelhecimento da pele (colagenase, elastase e hialuronidase), da capacidade de influenciar o crescimento de microrganismos associados à microbiota da pele (Staphylococcus epidermis, Cutibacterium acnes e Malassezia furfur) e da capacidade citoprotetora e fotoprotetora numa condição de stress oxidativo induzida por peróxido de hidrogénio (H2O2) e por UVB nas células HaCaT, respetivamente. A citotoxicidade das frações foi avaliada em fibroblastos (3T3) e queratinócitos (HaCaT). Todas as frações foram caracterizadas por espectroscopia UV-Vis. A fração biologicamente mais ativa foi analisada por HPLC-DAD e LC-MS, numa tentativa de identificar os compostos responsáveis pelas bioatividades demonstradas. Todas as frações demonstraram ter propriedades antioxidantes, no entanto, as frações F3, F5 e F10 destacaram-se pela sua elevada capacidade de estabilizar radicais livres nos ensaios efetuados. No ensaio de DPPH, a fração F10 destacou-se com a maior capacidade de redução deste radical (EC50 de 38,55 μg/ mL), seguida das frações F3 (157,60 μg/ mL) e F5 (244,70 μg/ mL). Relativamente aos ensaios FRAP e ORAC, F10 demonstrou a maior capacidade antioxidante exibindo um valor de 2.378,20 ± 14,40 Eq FeSO4/ g extrato e 16.322,80 ± 576,20 μmol Eq Trolox/ g extrato, respetivamente. Já as frações F3 e F5 apresentaram valores mais baixos quando comparados com a fração F10 no ensaio FRAP (F3 - 1821,76 ± 37,82 μM Eq FeSO4/ g extrato e F5 - 1180,28 ± 117,00 μM Eq FeSO4/ g extrato) e no ensaio ORAC (F3 - 3557,94 ± 466,60 μmol Eq Trolox/ g extrato e F5 - 4273,78 ± 181,80 μmol Eq Trolox/ g extrato). Estas frações foram as que exibiram maior conteúdo em polifenóis (F3 – 362,06 ± 12,10 mg Eq P/ g extrato; F5 – 309,47 ± 6,30 mg Eq P/ g extrato e F10 – 1677,90 ± 24,13 mg Eq P/ g extrato). No efeito antienzimático, a fração F10 demonstrou a maior capacidade inibitória para as enzimas colagenase (IC50 = 0,04 μg/ mL) e elastase (IC50 = 3,01 μg/ mL), não tendo um efeito notório contra a hialuronidase. Por sua vez a fração F4 exibiu capacidade para inibir a atividade de todas as enzimas, nomeadamente a colagenase (IC50 = 40,40 μg/ mL), a elastase (IC50 = 67,78 μg/ mL) e a hialuronidase (IC50 = 61,10 μg/ mL). Na citotoxicidade, a fração F10 apresenta efeitos citotóxicos nas células 3T3 à concentração de 1000 μg/ mL, no entanto, quando testada a 600 μg/ mL não demonstrou qualquer efeito na viabilidade celular dos fibroblastos e nas células HaCaT não exibiu qualquer citotoxicidade. Quanto às restantes frações, apresentaram baixa citotoxicidade (viabilidade acima dos 65%) nas células 3T3 e nenhum efeito citotóxico nas células HaCaT. No que diz respeito ao efeito fotoprotetor, as frações F7 e F10 inibiram ativamente a produção de espécies reativas de oxigénio quando as células HaCaT foram tratadas com H2O2 (F7 - IC50 = 99,50 μg/ mL e F10 - IC50 = 41,30 μg/ mL) e quando expostas a UVB (F7 - IC50 = 100,30 μg/ mL e F10 - IC50 = 31,30 μg/ mL). Relativamente aos efeitos das frações no crescimento dos microrganismos referidos, a fração F2 inibiu o crescimento de C. acnes (IC50 de 905,60 μg/ mL) e F7 inibiu o crescimento de M. furfur (IC50 de 1018,00 μg/ mL). No entanto, a fração F10 estimulou o crescimento de S. epidermidis. Por fim, a caraterização química por LC-MS da fração mais promissora, F10, revelou a presença de vários compostos fenólicos do grupo dos florotaninos. Em suma, em face dos resultados obtidos, e numa perspetiva geral, as diferentes frações de Fucus spiralis demonstram potencial cosmético, destacando-se a fração F10 pelas bioatividades evidenciadas. Esta fração poderá vir a ser explorada para aplicações cosméticas, através da sua inclusão em formulações com atividade antioxidante, antienzimática e fotoprotetora, aliada à capacidade de manutenção da microbiota da pele.
- Estudo do efeito neuroprotetor de terpenos isolados da alga Sphaerococcus coronopifolius num modelo in vitro da doença de Parkinson.Publication . Granados, Juan José Córdoba; Pedrosa, Rui Filipe Pinto; Alves, Celso Miguel da Maia; Gaspar, HelenaParkinson´s disease (PD) is a neurodegenerative illness characterized by the progressive loss of dopaminergic cells and the formation of Lewy bodies in the substantia nigra pars compacta, leading to motor system dysfunctions such as resting tremor and bradykinesia, affecting autonomy and cognition. Furthermore, following the growing pattern of old-age population, the discovery of new therapeutic agents able to prevent or treat this condition is of utmost importance. In this context, especially when compared with terrestrial environment, marine environment represents a vast area that still remains widely unexplored, constituting a huge source of interesting secondary metabolites with unusual chemical structures with several biological activities, including neuroprotective activities. Therefore, the objective of this dissertation was to isolate compounds from the red seaweed, Sphaerococcus coronopifolius, aiming to evaluate their antioxidant and neuroprotective activities on an in vitro cellular model of PD. The isolation and purification of compounds was achieved through preparative chromatographic techniques, namely column chromatography and thin layer chromatography. Structural elucidation of compounds was determined by nuclear magnetic resonance (NMR). Regarding biological activities, antioxidant activity of compounds (1 – 100 µM) was evaluated through the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) methods. The neuroprotective activity was evaluated on SH-SY5Y human neuroblastoma cellular model, which was exposed to the neurotoxin 6-hydroxy-dopamine (6-OHDA- 100 µM), mimicking PD effects, in absence and/or presence of the compounds (0.3, 1, 3 and 10µM; 24 h). Several biomarkers linked to the loss of dopaminergic neuronal cells, namely production of reactive oxygen species (ROS), alterations of mitochondrial membrane potential (MMP), and Caspase 3 activity were evaluated. The cytotoxicity of compounds was evaluated both on SH-SY5Y neuronal cells and on fibroblasts (3T3 cells). In our results, four compounds were isolated and when compared to NMR literature data they were identified as the sesquiterpene alloaromadendrene and the brominated diterpenes (1), sphaerococcenol A (2), 12S-hydroxy-bromosphaerol (3) and 12R-hydroxy- bromosphaerol (4). These terpenes revealed weak antioxidant activity compared to ascorbic acid in all methods tested. Through the ORAC assay, 12R-hydroxy-bromosphaerol revealed the highest capacity to reduce peroxyl radicals compared with the remaining compounds. Regarding the neuroprotective activities, treatment of SH-SY5Y cells with 6- OHDA decreased cell viability in approximately 50%, an effect that was mediated by an increase of ROS production, a depolarization of mitochondrial membrane potential and a stimulation of Caspase-3 activity. On the other hand, when SH-SY5Y cells were exposed to 6-OHDA in the presence of 12R-hydroxy-bromosphaerol there was an increase of SH- SY5Y cell viability of 24%, 23% and 18% at 3, 1 and 0.3 µM, respectively. The treatment with 1 µM 12R-hydroxy-bromosphaerol promoted a significant decrease of ROS levels (9%) and the treatment with 3, 1, and 0.3 µM concentrations reduced the MMP depolarisation induced by 6-OHDA exposition in 13%, 19% and 35%. Furthermore, the treatment with 0.3 µM 12R-Hydroxy-bromosphaerol reduced Caspase-3 activity in 113% to values similar with vehicle situation. Sphaerococcenol A and alloaromadendrene did not revealed capacity to recover the neurotoxicity induced by 6-OHDA. In conclusion, 12R-hydroxy-bromosphaerol exhibited the highest neuroprotective activity that seems to be mediated by the inhibition of ROS production, MMP protection and Caspase-3 activity. Therefore, additional assays should be considered in order to validate the therapeutic potential of this compound in PD.
- Evaluation of phytotoxicity of seaweed extracts from the Portuguese coast on tomato plantsPublication . Durán Clerque, Roberto Fernando; Lemos, Marco Filipe Loureiro; Félix, Carina Rafaela Faria da Costa; Alves, Celso Miguel da MaiaPrevê-se que a população mundial mantenha um crescimento constante nos próximos anos, pelo que a gestão correcta da agricultura é imperativa para responder adequadamente à crescente procura de alimentos. Esta procura elevada levou à intensificação das actividades agrícolas, incluindo a implementação de produtos fitofarmacêuticos destinados a proteger os cultivos de organismos nocivos, pragas e doenças. Mas a utilização destas estratégias químicas apresenta efeitos nocivos para o ambiente e para a saúde humana. Neste contexto, o ambiente marinho representa uma fonte ampla e valiosa de novos compostos interessantes para substituir os atualmente utilizados. Embora os compostos de origem natural sejam considerados seguros para o consumo humano, o estudo do impacto real da sua aplicação continua a ser indispensável. Assim, o objetivo desta dissertação foi avaliar o potencial antioxidante de vinte e quatro extractos diferentes produzidos a partir das algas marinhas Asparagopsis armata, Codium sp., Fucus vesiculosus e Sargassum muticum, bem como a fitotoxicidade dos extractos aquoso e hidroetanólico. A preparação dos extractos foi realizada através de uma extração sólido-líquido com água, etanol e água (75:25), apenas etanol, acetato de etilo e n-hexano como solventes. No que diz respeito às actividades biológicas, a atividade antioxidante dos compostos foi avaliada através dos métodos 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), capacidade de absorção do radical oxigénio (ORAC) e poder antioxidante redutor férrico (FRAP), bem como o conteúdo fenólico total (TPC). O efeito fitotóxico foi avaliado, em primeiro lugar, por um ensaio in vitro de punção das folhas, no qual folhas destacadas de tomateiro (Solanum lycopersicum; Solanaceae) foram aplicadas extractos previamente preparados em três concentrações diferentes (0,1; 0,5; e 1,0 mg/mL). Posteriormente, uma segunda abordagem foi avaliada em um ensaio in vivo em estufa, onde extratos aquosos liofilizados e hidroetanólicos foram aplicados em plantas de tomate por pulverização, semanalmente, durante 42 dias. A análise dos extractos revelou valores baixos de conteúdo fenólico total. Os extractos hidroetanólico e etanólico de F. vesiculosus apresentaram os valores mais 2 elevados. No contexto da atividade de redução do radical DPPH, F. vesiculosus (hidroetanólico, etanólico e acetato de etilo), A. armata (acetato de etilo) e S. muticum (etanólico) apresentaram os resultados mais promissores, reduzindo mais de 50% do radical DPPH. Relativamente ao método FRAP, os resultados foram significativamente inferiores aos do BHT. Por outro lado, o resultado obtido no método ORAC foi significativamente superior ao do BHT, mas ainda muito baixo em comparação com outros compostos antioxidantes, como o ácido ascórbico. Em relação ao ensaio de punção foliar, os extractos não apresentaram diferenças significativas quando comparados com os controlos avaliados. Por outro lado, as plantas em estudo in vivo após 42 dias de tratamento não mostraram nem fitotoxicidade nem efeito bioestimulante. Em conclusão, foram obtidos diferentes extractos de quatro algas marinhas diferentes e, globalmente, mostraram uma fraca capacidade antioxidante. Não se verificou qualquer efeito de fitotoxicidade nas plantas, no entanto, a temperatura elevada durante o período experimental na estufa foi um fator que afectou negativamente o crescimento das plantas de tomate. Embora nas condições apresentadas não tenha havido efeito positivo nas plantas, o facto de não ter apresentado efeito negativo e fitotoxicidade é favorável ao desenvolvimento de produtos com outras acções, como os biopesticidas.
- Evaluation of the antioxidant and anti-inflammatory potential of the marine sponge Cliona celata and assessment of its chemical profilePublication . Rosa, Joana Alves Branco; Pedrosa, Rui Filipe Pinto; Gaspar, Helena; Alves, Celso Miguel da MaiaA inflamação é um mecanismo antagónico, que tanto pode ter efeitos protetores como consequências devastadoras no organismo que, combinadas com stress oxidativo (OS), podem levar ao desenvolvimento de condições inflamatórias crónicas mortais. Ao longo dos anos, diversos trabalhos de investigação têm demonstrado o potencial dos produtos naturais marinhos (MNP), como agentes anti-inflamatórios. Dentro dos organismos marinhos, as esponjas destacam-se como um dos organismos com maior potencial de produção de compostos bioativos. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial antioxidante e anti-inflamatório da esponja marinha Cliona celata, e analisar o seu perfil químico. A atividade antioxidante dos extratos brutos de C. celata foi avaliada através de três ensaios complementares: capacidade de redução do radical 2,2-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), capacidade de redução do ião ferro3+ (FRAP) e capacidade de absorção dos radicais de oxigénio (ORAC). O efeito destes extratos na viabilidade das células RAW 264.7 foi também estudado. Simultaneamente, foi desenvolvido e otimizado um modelo in vitro em células RAW 264.7 para avaliação das propriedades anti-inflamatórias dos extratos, após indução de inflamação com lipopolissacarídeos (LPS) através do ensaio de óxido nítrico (NO). De modo semelhante, o potencial antioxidante, citotóxico e anti-inflamatório das frações de C. celata também foi testado. Posteriormente, foi avaliado o efeito dos extratos brutos e das duas frações mais promissoras de C. celata nos níveis dos mediadores inflamatórios, factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), (interleucina-6) IL-6 e (interleucina-10) IL-10 pelo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Por fim, foram utilizadas técnicas cromatográficas, como a cromatografia em camada fina analítica (TLC), cromatografia líquida de alta eficiência com detetor de matriz de díodos (HPLC-DAD) e cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa (GC-MS), para analisar o perfil químico dos extratos e frações. Uma tentativa de identificação dos compostos presentes nas duas frações mais promissoras foi efetuada por GC-MS. À concentração de 200 μg.mL-1, o potencial antioxidante dos extratos brutos e das frações selecionadas foi reduzido quando comparado com o hidroxitolueno butilado (BHT) nos ensaios de DPPH e FRAP. No entanto, os extratos brutos Cc_1 e Cc_7, bem como as frações Cc_1_F13 e Cc_1B_F15, apresentaram valores significativamente superiores aos do BHT no ensaio ORAC, atingindo valores de 239,37 ± 7,50; 248,91 ± 6,74; 249,47 ± 17,58 e 213,68 ± 22,73 μmol equivalentes de Trolox.g-1 de extrato de esponja, respetivamente. Na otimização do modelo anti-inflamatório, 50000 células por poço, 16 horas de tempo de plaqueamento e uma concentração de 1000 ng.mL-1 de LPS, provaram ser as condições ideais para o ensaio de NO. À concentração de 200 μg.mL-1, os extratos não foram citotóxicos para as células RAW 264.7 e apresentaram capacidade de inibir a produção de NO nas células induzidas por LPS. O extrato mais promissor (Cc_1) apresentou valores percentuais de controlo de 110,87 ± 12,08%, valor significativamente inferior aos 570,74 ± 26,97% apresentados pelo grupo dos LPS. Na faixa de 100-200 μg.mL-1, apenas 5 frações não foram citotóxicas para as células RAW 264.7. As duas frações mais promissoras (Cc_1_F5 e Cc_1_F13) apresentaram valores percentuais de produção de NO do controlo de 113,60 ± 2,55% e 107,28 ± 3,07%, respetivamente, também significativamente inferiores aos 597,66 ± 15,84% exibidos pelo grupo dos LPS. No ELISA, as amostras foram capazes de reduzir eficientemente os níveis da citocina pró-inflamatória IL-6 (em concentrações de amostra variando de 100 a 200 μg.mL-1), apresentando valores na gama de 7,57 ± 2,06 a 217,20 ± 58,62 pg.mL-1, que foram significativamente mais baixos do que os 775,91 ± 41,93 pg.mL-1 exibidos pelo grupo dos LPS. Da mesma forma, as amostras apresentaram um potencial promissor, aumentando os níveis da citocina anti-inflamatória IL-10, com a amostra mais potente (Cc_1) exibindo valores de 1040,68 ± 54,95 pg.mL-1, quando comparados com os níveis mínimos de 0,00 ± 2,37 e 181,03 ± 64,08 pg.mL-1, exibidos pelo grupo do controlo e dos LPS, respetivamente. Nenhum dos extratos teve efeito na redução dos níveis de TNF-α. A análise química dos extratos brutos revelou uma elevada complexidade e grande diversidade de compostos em todos os extratos, o que foi sustentado pela disparidade do perfil químico observado entre as frações obtidas. A análise por GC-MS das duas frações mais promissoras (Cc_1_F5 e Cc_1_F13) conduziu a uma proposta de identificação dos compostos ciclo-octasiloxano, ácido n-hexadecanóico, cis-9-hexadecenal e 13-octadecenal na primeira fração, e ácido octadecanóico e colesterol na segunda. Os resultados do presente trabalho demonstram a promissora atividade anti-inflamatória dos extratos e frações da esponja marinha C. celata, destacando o seu potencial como fonte de compostos com possível aplicação terapêutica no tratamento de doenças inflamatórias crónicas.
- Evaluation of the dermatological potential of the macroalgae Bifurcaria bifurcataPublication . Luz, Inês Filipa Rodrigues da; Pintéus, Susete Filipa Gonçalves; Alves, Celso Miguel da Maia; Martins, Alice Isabel MendesThe skin is the largest organ of the human body and has a major role in maintaining internal homeostasis. Due to the increasing awareness of the importance of skin, there is a great demand for new and natural skin care products. Seaweeds have revealed to be a rich source of bioactive compounds with relevant biological activities for a wide range of dermatological applications. Thus, the aim of this study was to evaluate the dermatological potential of the brown seaweed Bifurcaria bifurcata regarding its antioxidant, antienzymatic, cytotoxic, photoprotective, wound healing, and antimicrobial properties. The freeze-dried seaweed was extracted with ethanol: water (70:30, v/v) and the crude extract was subjected to a liquid-liquid partition with cyclohexane, ethyl acetate, and water, affording six fractions (F1-F6), which chemical profile was analysed by ultraviolet-visible spectroscopy (UV-Vis) and proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). Several in vitro assays were performed to assess their dermatological potential, namely: (i) antioxidant (total phenolic content (TPC), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, superoxide anion (SOD) reduction, Fe (III) reduction power (FRAP), and oxygen free radical scavenging capacity (ORAC)); ii) antienzyme (collagenase, elastase, hyaluronidase, and tyrosinase); iii) cytotoxicity in HaCat cells; iv) photoprotective (ROS production) in HaCaT cells exposed to ultra-violet radiation A/B (15 min at 7.9 mW/ cm2); v) healing (scratching method) in HaCaT cells; and, iv) antimicrobial (S. aureus, S. hominis, S. epidermidis, C. acnes, and M. furfur) activities. The ethyl acetate fraction (F4) demonstrated a high antioxidant potential, with the highest ability to reduce the DPPH radical (EC50: 35.7 μg/mL) and SOD (EC50: 83.7 μg/mL), together with the highest values of FRAP (4982 μM FeSO4/g), ORAC (2418.6 μmol TE/g), and TPC (626.5 mg PE/g). Regarding the antienzymatic activity, this fraction also demonstrated the best potential to inhibit collagenase (IC50: 50.1 μg/mL) and tyrosinase (IC50: 33.6 μg/mL) activities. Additionally, fractions F2 (IC50: 120.5 μg/mL) and F3 (IC50: 99.3 μg/mL), demonstrated the highest ability to reduce hyaluronidase activity. The photoprotective and healing capacity was performed on HaCaT cells at non-toxic concentrations. The hydrophilic fraction (F5) mediated the highest ROS reduction (30.9%) on HaCaT cells exposed to UVA/B radiation, while the most lipophilic fraction (F2) promoted the highest healing area (47.3%). Regarding the antimicrobial activity, the cyclohexane fraction (F3) showed the best inhibitory potential against Staphylococcus epidermidis (48.5% at 200 μg/mL) and, together with F2, also against Cutibacterium acnes (IC50: 59.0 and 63.1 μg/mL, respectively). The obtained results suggest that this seaweed can be regarded as a potential source of bioactive ingredients for further dermatological applications, justifying the importance of more and deeper studies aiming its use in new and sustainable cosmetic formulations.
- Isolamento de fungos do ambiente marinho e avaliação do seu potencial biotecnológicoPublication . Santos, Luís Filipe Martins; Campos, Maria Jorge Geraldes; Calado, Maria da Luz Jeremias Cardinha do Maio; Alves, Celso Miguel da MaiaA biotecnologia, está em constante crescimento, utiliza matéria e recursos biológicos para a produção e desenvolvimento de novos produtos. As enzimas, são biocatalisadores que aceleram e tornam as reações bioquímicas mais eficientes, possuindo uma elevada importância em diversas áreas, como, por exemplo, na indústria (papel, farmacêutica, biocombustíveis, entre outras), na biorremediação e na saúde para fins terapêuticos. O interesse na descoberta de novas enzimas com caraterísticas específicas, como atividade a temperaturas baixas e a diferentes intervalos de pH, é constante. O ambiente marinho é um dos maiores habitats do planeta Terra, albergando uma grande biodiversidade. Diversos organismos marinhos têm revelado ser uma fonte de vários componentes benéficos para a sociedade com capacidade citotóxica, anti-inflamatória, antiviral, atividade enzimática, entre outras. Entre os organismos marinhos, os fungos têm demonstrado possuir um papel ecológico na recirculação do carbono, assim como fonte de diversos compostos bioativos e enzimas. Os fungos arenícolas são um grupo ecológico, associados às praias arenosas, sobre o qual o conhecimento é limitado e que estão sujeitos a pressões antropogénicas, um fator de stress para estes organismos. Neste trabalho pretendeu-se conhecer a comunidade e avaliar a produção de enzimas em fungos arenícolas isolados de amostras de areia recolhidas em 3 praias (Molhe Leste, Supertubos e Consolação) do concelho de Peniche, Portugal. Para isto procedeu-se ao isolamento dos fungos arenícolas existentes nas amostras de areia, os quais foram identificados recorrendo a métodos de biologia molecular (PCR). Posteriormente realizou-se um screening para avaliar a capacidade dos fungos em produzirem enzimas, nomeadamente amílase, celulase, lacase, lípase, protease e xilanase. No total foram identificados 47 fungos dos géneros Absidia, Acrocalymma, Acrostalagmus, Aspergillus, Cladosporium, Clonostachys, Fusarium, Lecanicillium, Microsphaeropsis, Neocamarosporium, Penicillium, Plectosphaerella, Pyrenochaetopsis, Rhizopus, Trichoderma, sendo o Aspergillus e o Penicillium os géneros mais representativos na comunidade amostrada. Além disso, foi registado, possivelmente, a primeira ocorrência de 3 espécies em ambiente marinho e de acordo com um estudo de revisão recente, o primeiro isolamento de 8 espécies e 4 géneros em Portugal. Foram observadas 16 espécies produtoras de amílases, 12 espécies produtoras de celulases, 12 espécies produtoras de lacases, 14 espécies produtoras de lípases, 39 espécies produtoras de proteases e 29 espécies produtoras de xilanases dos 3 locais de amostragem. Também se observou a produção de diferentes enzimas por diferentes estirpes da mesma espécie, isoladas no mesmo ou em diferentes locais de amostragem. Em suma, os fungos arenícolas demonstram ser uma fonte relevante de enzimas com potencial de aplicação para diferentes áreas.
- Potencial dermocosmético da macroalga Carpomitra costataPublication . Susano, Patrícia Frederico; Pedrosa, Rui Filipe Pinto; Alves, Celso Miguel da Maia; Martins, Alice Isabel MendesO crescente interesse da população por uma aparência jovem e uma pele saudável, sobretudo em sociedades desenvolvidas, tem conduzido a um elevado crescimento da indústria cosmética. Um dos focos desta indústria é a busca de novos ingredientes naturais com uma ampla gama de bioatividades, com propriedades antienvelhecimento, antioxidantes, anti-inflamatórias, antimicrobianas, fotoprotetoras, entre outras, a fim de produzir novos produtos para responder à crescente procura por formulações de origem natural, face ao conhecimento sobre os perigos de alguns ingredientes sintéticos. Neste sentido, as macroalgas são apontadas como fortes candidatas, dada a sua capacidade para biossintetizar compostos com caraterísticas estruturais únicas e de elevado potencial biológico. Deste modo, o objetivo desta dissertação de mestrado consistiu em avaliar o potencial dermocosmético da macroalga castanha Carpomitra costata, recolhida na costa de Peniche, Portugal. A amostra liofilizada de C. costata foi extraída com etanol: água (70:30) sendo o extrato total seco submetido a uma partição líquido-líquido, de onde resultaram cinco frações distintas (F1 – F5). O perfil químico destas frações foi analisado por espetroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis) e ressonância magnética nuclear (RMN), recorrendo-se a diversos ensaios in vitro para avaliar o seu potencial dermatológico, nomeadamente, a sua capacidade: i) antioxidante (quantificação total de compostos fenólicos (QTP), redução do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), capacidade de redução do Fe (III) (FRAP) e capacidade de absorção dos radicais livres de oxigénio (ORAC)); ii) antienzimática (colagenase, hialuronidase, elastase e tirosinase), iii) antimicrobiana (Staphylococcus epidermidis, Cutibacterium acnes, Malassezia furfur), iv) fotoprotetora (produção de espécies reativas de oxigénio (ROS)); e v) anti-inflamatória (produção de óxido nítrico (NO), fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-10 (IL-10)). A fração de acetato de etilo (F3) demonstrou um elevado potencial antioxidante, com a maior capacidade de redução do radical DPPH (EC50 de 140,1 μg/mL) e os valores mais elevados de FRAP (474,6 ± 50,1 μM FeSO4/g) e ORAC (2082,4 ± 179,3 μM TE/g), bem como o maior teor de compostos fenólicos (321,3 ± 20,7 mg PE/g extrato). Em relação à atividade antienzimática, esta fração demonstrou igualmente o maior potencial, inibindo as atividades das enzimas colagenase (IC50 de 7,2 μg/mL), elastase (IC50 de 4,8 μg/mL) e tirosinase (IC50 de 85,9 μg/mL). Por sua vez, as frações F1 (IC50 de 47,2 μg/mL), F2 (IC50 de 46,2 μg/mL) e F5 (IC50 de 48,1 μg/mL) revelaram o maior potencial de inibição da enzima hialuronidase. Quanto à atividade antimicrobiana, a fração F3, apesar de não ser a mais eficaz, reduziu significativamente o crescimento de S. epidermidis e M. furfur, 24,1 ± 3,1% e 21,0 ± 4,4%, respetivamente. Contudo, a fração com maior atividade antimicrobiana foi a fração F5, inibindo o crescimento de S. epidermidis (IC50 de 72,0 μg/mL) e C. acnes (IC50 de 46,3 μg/mL). As frações F1 (IC50 de 141,4 μg/mL) e F2 (IC50 de 45,9 μg/mL) também demonstraram eficácia na inibição de C. acnes. De modo a avaliar a capacidade fotoprotetora das frações de C. costata, foi selecionada a concentração que não induziu citotoxicidade (10 μg/mL) nos fibroblastos 3T3. A esta concentração, todas as frações reduziram significativamente a produção de ROS induzida pela exposição à radiação UV, no entanto, o efeito mais marcado foi evidenciado pelas frações F2 e F3, as quais reduziram a produção de ROS em 33,1% e 32,9%, respetivamente. Relativamente às propriedades anti-inflamatórias, foi realizado previamente um ensaio de citotoxicidade em macrófagos. À concentração de 20 μg/mL, nenhuma das frações de C. costata reduziu a viabilidade celular, sendo esta a concentração utilizada na avaliação da atividade anti-inflamatória. Nenhuma das frações demonstrou estimular a produção de óxido nítrico (NO). Contudo, quando as células RAW 264.7 foram expostas a uma condição de inflamação induzida através do tratamento com lipopolissacarídeos (LPS), verificou-se um aumento dos níveis de NO, TNF-α e IL-6. Nenhuma das frações demonstrou capacidade para reduzir os níveis de NO, no entanto, algumas frações reduziram significativamente os níveis de outros mediadores inflamatórios estudados, nomeadamente TNF-α e IL-6. No que respeita ao TNF-α, todas as frações mostraram eficácia na redução dos níveis desta citocina, contudo, as frações F2 e F5 revelaram o maior potencial, reduzindo os seus níveis para 145,5 ± 29,8% e 136,8 ± 21,7%, respetivamente, em relação ao tratamento com LPS (564,2 ± 54,9%). Quanto à IL-6, todas as frações reduziram significativamente os seus níveis, sendo a fração F2 a que apresentou o efeito mais marcado, reduzindo os seus níveis de 327,5 ± 34,4% para 106,7 ± 2,0%. Por último, nenhuma das frações demonstrou capacidade em estimular a produção da citocina anti-inflamatória IL-10. A análise do espetro de RMN da fração com maior potencial bioativo (F3) evidenciou sinais caraterísticos de polifenóis (florotaninos), os quais poderão estar associados às bioatividades observadas. Em suma, os resultados obtidos destacam a macroalga C. costata como uma fonte de ingredientes bioativos para potenciais aplicações dermatológicas, através da sua incorporação em diferentes formulações tópicas com propriedades antioxidantes, fotoprotetoras, antienvelhecimento, antimicrobianas e anti-inflamatórias.
- Potencial neuroprotetor de compostos naturais marinhos de macroalgas num modelo celular da doença de AlzheimerPublication . Carvalho, Ana Filipa da Silva; Silva, Joana Rita Martins da; Alves, Celso Miguel da Maia; Pedrosa, Rui Filipe PintoO aumento da esperança média de vida tem levado ao aumento da população idosa, originando uma prevalência de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer. Até ao momento, não foi encontrado um tratamento eficaz contra esta e, por isso, é importante procurar novas soluções terapêuticas. Assim, o objetivo desta dissertação foi implementar um modelo de stress oxidativo induzido com peróxido de hidrogénio (H2O2) em células SH-SY5Y e avaliar o potencial protetor de compostos marinhos isolados de macroalgas, assim como os biomarcadores associados aos efeitos neuroprotetores demonstrados. Os compostos foram isolados por técnicas cromatográficas, cujas estruturas foram elucidadas por 1H-RMN e GC-MS. A capacidade anti-enzimática dos compostos foi avaliada na atividade da enzima AChE e BACE-1. A citotoxicidade do H2O2 (1 – 10 000 μM) e dos compostos (0,01 – 100 μM) foi avaliada nas células SH-SY5Y, após 24 h de incubação, e os efeitos foram estimados pelo método MTT. A avaliação do potencial neuroprotetor foi avaliada através da indução de citotoxicidade com o H2O2 (200 μM). De modo a compreender as vias de sinalização envolvidas na atividade citoprotetora, biomarcadores celulares foram estudados, nomeadamente quantificação de espécies reativas de oxigénio, alterações do potencial de membrana mitocondrial e atividade da Caspase-3. Foram isolados três compostos identificados como eleganolone, loliolide e sphaerococcenol A a partir das macroalgas Bifurcaria bifurcata, Codium tomentosum e Sphaerococcus coronopifolius. Para além destes, três compostos hemi-sintéticos análogos do sphaerococcenol A (compostos 1, 5 e 6) foram também estudados. Foi utilizado ainda o D-manitol e o α-tocoferol. Em relação à atividade enzimática, a maioria dos compostos apresentaram capacidade de inibição da enzima BACE-1. Contudo, nenhum composto apresentou capacidade de inibição da enzima AChE. Nos ensaios de citotoxicidade o H2O2 (100 – 10 000 μM) demonstrou reduzir entre 40-50% a viabilidade celular. Na presença dos compostos às concentrações não tóxicas, verificou-se que o sphaerococcenol A, composto 6 e D-manitol sem pré-incubação e quando pré-incubado apresentaram capacidade de reduzir a citotoxicidade. No que respeita ao estudo dos mecanismos de ação, verificou-se que o tratamento induzido com H2O2 causou aumento da atividade da Caspase-3, que foi revertido, mais marcadamente, pelo composto 6. Os compostos sphaerococcenol A e D-manitol com pré-incubação preveniram a diminuição da disfunção mitocondrial induzida pela exposição ao H2O. No ensaio de produção de espécies reativas de oxigénio, não se verificou diferenças estatísticas entre os compostos e o H2O2. Em suma, os resultados demonstraram o potencial dos compostos sphaerococcenol A, composto 6 e D-manitol como os mais promissores, diminuindo a atividade da enzima BACE-1 e apresentando efeito citoprotetor nas células neuronais contra o H2O2. Este efeito pareceu ser mediado por redução da atividade da Caspase-3 e prevenção da alteração do potencial de membrana mitocondrial. Os dados indicam assim que estes apresentam potencial como agentes terapêuticos em células do neuroblastoma humano, podendo ser considerados para a realização de mais estudos de modo a compreender o seu potencial terapêutico no tratamento da DA.