Evaluation of the antioxidant and anti-inflammatory potential of the marine sponge Cliona celata and assessment of its chemical profile

Rosa, Joana Alves Branco

http://hdl.handle.net/10400.8/5124

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Authors

Rosa, Joana Alves Branco

Advisor(s)

Pedrosa, Rui Filipe Pinto

Gaspar, Helena

Alves, Celso Miguel da Maia

Abstract(s)

A inflamação é um mecanismo antagónico, que tanto pode ter efeitos protetores como consequências devastadoras no organismo que, combinadas com stress oxidativo (OS), podem levar ao desenvolvimento de condições inflamatórias crónicas mortais. Ao longo dos anos, diversos trabalhos de investigação têm demonstrado o potencial dos produtos naturais marinhos (MNP), como agentes anti-inflamatórios. Dentro dos organismos marinhos, as esponjas destacam-se como um dos organismos com maior potencial de produção de compostos bioativos. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial antioxidante e anti-inflamatório da esponja marinha Cliona celata, e analisar o seu perfil químico. A atividade antioxidante dos extratos brutos de C. celata foi avaliada através de três ensaios complementares: capacidade de redução do radical 2,2-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), capacidade de redução do ião ferro3+ (FRAP) e capacidade de absorção dos radicais de oxigénio (ORAC). O efeito destes extratos na viabilidade das células RAW 264.7 foi também estudado. Simultaneamente, foi desenvolvido e otimizado um modelo in vitro em células RAW 264.7 para avaliação das propriedades anti-inflamatórias dos extratos, após indução de inflamação com lipopolissacarídeos (LPS) através do ensaio de óxido nítrico (NO). De modo semelhante, o potencial antioxidante, citotóxico e anti-inflamatório das frações de C. celata também foi testado. Posteriormente, foi avaliado o efeito dos extratos brutos e das duas frações mais promissoras de C. celata nos níveis dos mediadores inflamatórios, factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), (interleucina-6) IL-6 e (interleucina-10) IL-10 pelo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Por fim, foram utilizadas técnicas cromatográficas, como a cromatografia em camada fina analítica (TLC), cromatografia líquida de alta eficiência com detetor de matriz de díodos (HPLC-DAD) e cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa (GC-MS), para analisar o perfil químico dos extratos e frações. Uma tentativa de identificação dos compostos presentes nas duas frações mais promissoras foi efetuada por GC-MS. À concentração de 200 μg.mL-1, o potencial antioxidante dos extratos brutos e das frações selecionadas foi reduzido quando comparado com o hidroxitolueno butilado (BHT) nos ensaios de DPPH e FRAP. No entanto, os extratos brutos Cc_1 e Cc_7, bem como as frações Cc_1_F13 e Cc_1B_F15, apresentaram valores significativamente superiores aos do BHT no ensaio ORAC, atingindo valores de 239,37 ± 7,50; 248,91 ± 6,74; 249,47 ± 17,58 e 213,68 ± 22,73 μmol equivalentes de Trolox.g-1 de extrato de esponja, respetivamente. Na otimização do modelo anti-inflamatório, 50000 células por poço, 16 horas de tempo de plaqueamento e uma concentração de 1000 ng.mL-1 de LPS, provaram ser as condições ideais para o ensaio de NO. À concentração de 200 μg.mL-1, os extratos não foram citotóxicos para as células RAW 264.7 e apresentaram capacidade de inibir a produção de NO nas células induzidas por LPS. O extrato mais promissor (Cc_1) apresentou valores percentuais de controlo de 110,87 ± 12,08%, valor significativamente inferior aos 570,74 ± 26,97% apresentados pelo grupo dos LPS. Na faixa de 100-200 μg.mL-1, apenas 5 frações não foram citotóxicas para as células RAW 264.7. As duas frações mais promissoras (Cc_1_F5 e Cc_1_F13) apresentaram valores percentuais de produção de NO do controlo de 113,60 ± 2,55% e 107,28 ± 3,07%, respetivamente, também significativamente inferiores aos 597,66 ± 15,84% exibidos pelo grupo dos LPS. No ELISA, as amostras foram capazes de reduzir eficientemente os níveis da citocina pró-inflamatória IL-6 (em concentrações de amostra variando de 100 a 200 μg.mL-1), apresentando valores na gama de 7,57 ± 2,06 a 217,20 ± 58,62 pg.mL-1, que foram significativamente mais baixos do que os 775,91 ± 41,93 pg.mL-1 exibidos pelo grupo dos LPS. Da mesma forma, as amostras apresentaram um potencial promissor, aumentando os níveis da citocina anti-inflamatória IL-10, com a amostra mais potente (Cc_1) exibindo valores de 1040,68 ± 54,95 pg.mL-1, quando comparados com os níveis mínimos de 0,00 ± 2,37 e 181,03 ± 64,08 pg.mL-1, exibidos pelo grupo do controlo e dos LPS, respetivamente. Nenhum dos extratos teve efeito na redução dos níveis de TNF-α. A análise química dos extratos brutos revelou uma elevada complexidade e grande diversidade de compostos em todos os extratos, o que foi sustentado pela disparidade do perfil químico observado entre as frações obtidas. A análise por GC-MS das duas frações mais promissoras (Cc_1_F5 e Cc_1_F13) conduziu a uma proposta de identificação dos compostos ciclo-octasiloxano, ácido n-hexadecanóico, cis-9-hexadecenal e 13-octadecenal na primeira fração, e ácido octadecanóico e colesterol na segunda. Os resultados do presente trabalho demonstram a promissora atividade anti-inflamatória dos extratos e frações da esponja marinha C. celata, destacando o seu potencial como fonte de compostos com possível aplicação terapêutica no tratamento de doenças inflamatórias crónicas.