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Publication
Development of a new ultra-fast freezing procedure for zebrafish sperm cryopreservation
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
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| 3.91 MB | Adobe PDF |
Abstract(s)
À medida que novas linhas novas geneticamente modificadas vão sendo geradas,
aumenta o desafio de manter este vasto número de peixes-zebra. Desta forma, a
criopreservação de esperma tem sido considerada uma ótima opção para o armazenamento
a longo prazo de material genético reduzindo assim custos inerentes à sua manutenção.
Os métodos tradicionais de criopreservação e vitrificação são os mais utilizados
para criopreservar células. A vitrificação apresenta inúmeras vantagens sobre o método
tradicional, entre as quais a não formação de cristais de gelo através de elevadas taxas de
arrefecimento. Desta forma, a concentração de agentes crioprotetores utilizados pode ser
menor, diminuindo o seu efeito tóxico nas células.
A falta de padronização e resultados coesos em estudos anteriores foram as
principais razões para o desenvolvimento de um método simples e consistente na
Plataforma de Peixes da Fundação Champalimaud. Desta forma, o objetivo principal desta
tese foi o desenvolvimento de um protocolo fácil, económico e coerente, designado por
congelamento ultra-rápido. Este método otimizado para a criopreservação de esperma de
peixe-zebra terá um impacto muito importante na comunidade científica.
De 23 protocolos testados (n = 201), foram escolhidos para criopreservação de esperma de
peixe-zebra os que apresentaram melhores resultados tendo em conta a percentagem de
recuperação de linhas, a taxa média de fertilização, a taxa média de sobrevivência das
larvas e a taxa média de malformações. Desta forma, foram selecionados dois protocolos
com combinações de extender e crioprotector distintas.
Em relação aos métodos complementares utilizados na otimização do protocolo de
criopreservação, a estimulação hormonal das fêmeas com 17α,20β-DHP traduziu-se
claramente numa melhoria na qualidade e quantidade dos oócitos, sendo um passo muito
importante na otimização deste protocolo; a quantificação da concentração de esperma é útil
apenas com amostras translúcidas, no entanto indicou que a concentração de esperma não
pode ser correlacionada com a taxa de fertilização; o protocolo otimizado de FIV (fertilização
in vitro) é, no momento, um serviço prestado pela Plataforma de Peixes da Fundação
Champalimaud.
Paralelamente à otimização da criopreservação de esperma, foi otimizado um
protocolo de transgénese usando o sistema de transposão Tol2 com microinjeção in vitro de oócitos seguido pela técnica de FIV otimizada anteriormente. Com este método, a
percentagem de fundadores transgénicos de uma linha transgénica estável foi de 66.67%,
muito superior à observada em microinjeção no estádio de zigoto. Foi ainda realizada uma
análise da viabilidade do esperma em peixes alimentados com duas dietas comerciais
(Skretting Gemma® e SparosZebrafeed®) tendo como conclusão que ambas as dietas são
semelhantes.
Description
Keywords
criopreservação fertilização in vitro esperma peixe-zebra