Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa in coastal waters (Peniche, Portugal)

Januário, Adriana Pereira

http://hdl.handle.net/10400.8/3249

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Dissertação de Mestrado Adriana Januario BRM.PDF		1.49 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Januário, Adriana Pereira

Advisor(s)

Rodrigues, Maria José Ribeiro Machado

Afonso, Clélia Paulete Correia Neves

Abstract(s)

Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo que possui requisitos mínimos para sobreviver, tendo uma habilidade notável para se adaptar a uma variedade de condições ambientais, estando apto para sobreviver em água destilada ou desionizada durante meses. Desde as últimas três décadas, P. aeruginosa tem vindo a ser uma das bactérias mais estudadas em saúde pública devido à sua capacidade de se poder tornar uma ameaça significativa como patogénico humano, causando infeções em quase todos os órgãos ou tecidos. Está associada a infeções no ouvido, olhos e pele, e causa infeções hospitalares sérias em pacientes com queimaduras ou com fibrose cística. A Diretiva 2006/7/EC estabelece disposições para a monitorização e a classificação da qualidade das águas balneares. Tem como propósito preservar, proteger e melhorar a qualidade do ambiente e proteger a saúde humana. No que toca a águas costeias, os parâmetros microbiológicos utilizados para classificar a qualidade das águas balneares, são enterococos intestinais (CFU/100 ml) e Escherichia coli (CFU/100 ml). P. aeruginosa não é incluído como critério microbiológico, nem tão pouco mencionado. Apesar disto, alguns autores recomendam limites para este microrganismo, sugerindo ausência em volumes de 100 ml de água. Mas, a associação entre a presença de indicadores de contaminação fecal (enterococos intestinais e E. coli) e a presença de microrganismos patogénicos não-entéricos parece não estar bem definida na literatura e, por essa razão, o propósito da primeira parte deste estudo foi estabelecer uma relação entre P. aeruginosa e esses indicadores. Os resultados revelaram uma relação positiva e moderada entre P. aeruginosa e E. coli. Assim sendo, aconselha-se a enumeração de P. aeruginosa, uma bactéria não-entérica, juntamente e completando a enumeração de E. coli e enterococos intestinais, sendo bactérias entéricas, já que são parâmetros definidos na Diretiva já mencionada. Desde os anos 60 que se têm vindo a utilizar técnicas convencionais microbiológicas para detetar e enumerar P. aeruginosa, sendo a filtração por membrana, o método mais utilizado. O procedimento na ISO 16266:2006 descreve o método de filtração por membrana para a deteção e enumeração de P. aeruginosa em amostras de água. Possuindo várias limitações, principalmente a dificuldade e morosidade da técnica, existe uma necessidade de desenvolver métodos alternativos que ultrapassem algumas das limitações encontradas nas metodologias clássicas. O novo método Pseudalert®/Quanti-Tray® MPN teste, desenvolvido pelos laboratórios da IDEXX, sinaliza a presença de P. aeruginosa em 24 horas. Esta metodologia foi formulada para água potável, de consumo e de piscina. Os resultados do presente estudo mostraram que não havia diferenças significativas quando comparado o método Pseudalert®/Quanti-Tray® MPN teste com a filtração por membrana, sugerindo que o novo teste pode ser considerado uma metodologia rápida para avaliar a contaminação por P. aeruginosa em águas costeiras. A principal limitação dos métodos de cultura microbiológicos, sejam eles tradicionais ou alternativos, é a sua incapacidade de detetar microrganismos viáveis, mas não cultiváveis. Ensaios que se baseiam em técnicas de PCR têm vindo a tornar-se mais atrativos, mas a maioria dos autores continua a utilizar procedimentos de enriquecimento ou crescimento em meio de cultura. Por isso, o objetivo da terceira parte do trabalho foi apontar uma metodologia de PCR para detetar P. aeruginosa sem qualquer crescimento bacteriano posterior. O tempo estimado do ensaio foi de 6 horas, permitindo a deteção da bactéria em estudo através da amplificação do gene ecfX utilizando a solução de lise TZ para extrair o ADN genómico presente nas membranas de filtração. Este ensaio pode ser uma alternativa viável às metodologias convencionais, quando aplicado à deteção de P. aeruginosa em águas costeiras marinhas.