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Publication
Mechanisms of action of Asparagopsis armata ethanolic extract against the shrimp pathogen Vibrio parahaemolyticus
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Authors
Abstract(s)
Environmental pollution, climate change and natural resource scarcity are some societal challenges that, nowadays, new sustainable production systems must respond to. For that, a greener bioeconomy concept based on biotechnological innovations should be implemented, creating new value chains and implementing the concept of Circular Economy. One example of creating new value chains from the environment is giving biotechnological value for invasive species as the macroalgae Asparagopsis armata.
Asparagopsis armata have already shown a variety of biotechnological applications, as in food and feed industries, including antimicrobial, antioxidant, among many other activities. In the aquaculture context, the inclusion of an ethanolic extract from this macroalgae in the feed of Litopenaeus vannamei showed higher survival rates (above 50%) when shrimps were infected with Vibrio parahaemolyticus, an increase in immunological responses, and a significant increase on the shelf life of the feed was also obtained.
The main goal of this dissertation was to unveil the potential mechanisms of action of this ethanolic extract facing Vibrio parahaemolyticus, using two complementary approaches, biochemical assays and real time quantification of several genes potentially involved.
The results obtained for the antimicrobial activity revealed that the ethanolic extract at 2mg/mL can totally inhibit the growth of V. parahaemolyticus, presenting MIC and MBC at this concentration, showing a similar pattern in the time-kill assay, performed to evaluate the growth of the bacteria in the presence of the extract at different concentrations along time. Regarding the viability activity, an increase of the activity was found in the presence of 1 mg/mL along time, while at 2mg/mL no viability activity was observed. The leakage of intracellular proteins through the bacterial membrane showed higher concentrations in the extracellular matrix when V. parahaemolyticus was in contact with the 2 mg/mL concentration and the biofilm formation was inhibited by the presence of the extract at the same concentration, both situations showing a similar behavior of the antibiotic control.
Considering the real time quantification of genes related with basal functions (rpoS) and genes related to virulence (tuf, toxR, luxR, pirA and pirB), increasing concentrations showed to increase the gene expression in general, with the exception of pirB gene. These results indicate that in the presence of 1/4 MIC concentration, V.parahaemolyticus had the necessity to increase the expression of genes that may contribute to the survival of the cells.
Conjugating all the data obtained in this study, important clues regarding the potential mechanisms of action of A. armata extract were deciphered, contributing not only to understand their antimicrobial potential but also to define crucial future work to entirely unveil the mechanism of action associated to this extract.
A poluição ambiental, alterações climáticas e a escassez de recursos naturais são alguns dos problemas da sociedade atual aos quais novos sistemas de produção sustentável devem conseguir responder. Para isso, deve ser implementado um conceito de bioeconomia mais verde com base em inovações biotecnológicas, ao criar novas cadeias de valor e implementando o conceito de Economia Circular. Um exemplo de criação de novas cadeias de valor a partir do meio ambiente é dar valor biotecnológico às espécies invasoras como a macroalga Asparagopsis armata. Asparagopsis armata já demonstrou uma variedade de aplicações biotecnológicas, como nas indústrias de alimentação e rações, incluindo antimicrobiana, antioxidante entre outras atividades. No contexto da aquacultura, a implementação de um extrato etanólico proveniente desta macroalga na dieta de Litopenaeus vannamei mostrou que os camarões apresentaram maiores taxas de sobrevivência (acima de 50%) aquando infetados com Vibrio parahaemolyticus, tendo também existido um aumento nas respostas imunológicas e um aumento significativo na vida de prateleira da ração. O principal objetivo desta dissertação foi desvendar os potenciais mecanismos de ação do extrato etanólico face a Vibrio parahaemolyticus, utilizando duas abordagens complementares, ensaios bioquímicos e quantificação em tempo real de vários genes potencialmente envolvidos. Os resultados obtidos para a atividade antimicrobiana revelaram que o extrato etanólico na concentração de 2 mg/mL é capaz de inibir totalmente o crescimento de V. parahaemolyticus, apresentando MIC e MBC a esta concentração, apresentando um padrão semelhante no ensaio de time-kill, realizado para avaliar o crescimento das bactérias na presença do extrato em diferentes concentrações ao longo do tempo. Em relação à atividade mitocondrial, observou-se um aumento da atividade mitocondrial à concentração de 1 mg/mL ao longo do tempo, enquanto na concentração de 2 mg/mL não se observou atividade mitocondrial. A fuga de proteínas através da membrana bacteriana mostrou maiores concentrações na matriz extracelular quando V. parahaemolyticus estava em contacto com a concentração de 2 mg/mL e a formação de biofilme foi inibida pela presença do extrato à mesma concentração, o que mostrou um comportamento semelhante ao controlo de antibiótico. Considerando a quantificação em tempo real dos genes envolvidos em funções basais (rpoS) e genes relacionados com a virulência (tuf, toxR, luxR, pira e pirB), ao aumentar a concentração do extrato mostrou um aumento da expressão genética de uma forma geral, com a exceção do gene pirB. Estes resultados indicam que na presença da concentração a 1/4 MIC, V. parahaemolyticus mostrou a necessidade de aumentar a expressão dos genes que podem contribuir para a sobrevivência das células. Combinando todos os dados obtidos neste estudo, pistas importantes sobre os potenciais mecanismos de ação do extrato de A. armata foram decifrados contribuindo, não só para perceber o seu potencial antimicrobiano, mas também, para definir trabalhos futuros cruciais para revelar inteiramente os mecanismos de ação associados a este extrato.
A poluição ambiental, alterações climáticas e a escassez de recursos naturais são alguns dos problemas da sociedade atual aos quais novos sistemas de produção sustentável devem conseguir responder. Para isso, deve ser implementado um conceito de bioeconomia mais verde com base em inovações biotecnológicas, ao criar novas cadeias de valor e implementando o conceito de Economia Circular. Um exemplo de criação de novas cadeias de valor a partir do meio ambiente é dar valor biotecnológico às espécies invasoras como a macroalga Asparagopsis armata. Asparagopsis armata já demonstrou uma variedade de aplicações biotecnológicas, como nas indústrias de alimentação e rações, incluindo antimicrobiana, antioxidante entre outras atividades. No contexto da aquacultura, a implementação de um extrato etanólico proveniente desta macroalga na dieta de Litopenaeus vannamei mostrou que os camarões apresentaram maiores taxas de sobrevivência (acima de 50%) aquando infetados com Vibrio parahaemolyticus, tendo também existido um aumento nas respostas imunológicas e um aumento significativo na vida de prateleira da ração. O principal objetivo desta dissertação foi desvendar os potenciais mecanismos de ação do extrato etanólico face a Vibrio parahaemolyticus, utilizando duas abordagens complementares, ensaios bioquímicos e quantificação em tempo real de vários genes potencialmente envolvidos. Os resultados obtidos para a atividade antimicrobiana revelaram que o extrato etanólico na concentração de 2 mg/mL é capaz de inibir totalmente o crescimento de V. parahaemolyticus, apresentando MIC e MBC a esta concentração, apresentando um padrão semelhante no ensaio de time-kill, realizado para avaliar o crescimento das bactérias na presença do extrato em diferentes concentrações ao longo do tempo. Em relação à atividade mitocondrial, observou-se um aumento da atividade mitocondrial à concentração de 1 mg/mL ao longo do tempo, enquanto na concentração de 2 mg/mL não se observou atividade mitocondrial. A fuga de proteínas através da membrana bacteriana mostrou maiores concentrações na matriz extracelular quando V. parahaemolyticus estava em contacto com a concentração de 2 mg/mL e a formação de biofilme foi inibida pela presença do extrato à mesma concentração, o que mostrou um comportamento semelhante ao controlo de antibiótico. Considerando a quantificação em tempo real dos genes envolvidos em funções basais (rpoS) e genes relacionados com a virulência (tuf, toxR, luxR, pira e pirB), ao aumentar a concentração do extrato mostrou um aumento da expressão genética de uma forma geral, com a exceção do gene pirB. Estes resultados indicam que na presença da concentração a 1/4 MIC, V. parahaemolyticus mostrou a necessidade de aumentar a expressão dos genes que podem contribuir para a sobrevivência das células. Combinando todos os dados obtidos neste estudo, pistas importantes sobre os potenciais mecanismos de ação do extrato de A. armata foram decifrados contribuindo, não só para perceber o seu potencial antimicrobiano, mas também, para definir trabalhos futuros cruciais para revelar inteiramente os mecanismos de ação associados a este extrato.
Description
This project was funded by COSMOS: Valorização biotecnológica da alga invasora Asparagopsis armata da Costa de Peniche (MAR-04.03.01-FEAMP-0370) through GAL PESCA OESTE and MAR2020 in the framework of PORTUGAL2020 and the European Maritime and Fisheries Fund. This project was also funded by Fundação para a Ciência e a
Tecnologia (FCT) through project MARINE INVADERS—The impact and mechanisms of success of the invasive seaweed Asparagopsis armata on coastal environments (POCI-01-0145-FEDER- 031144) and ORCHESTRA—add-value to ORCHards through thE full valoriSaTion of macRoalgAe (POCI-01-0247-FEDER-070155) cofounded by FEDER—Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional da União Europeia, Portugal2020, through
COMPETE 2020—Programa Operacional Competitividade e Internacionalização and through FCT.
Keywords
Bioeconomy Circular economy Gene expression Macroalgae Mechanisms of action Rhodophyta