Neuroprotective activity of sulfated polysaccharides isolated from macroalgae in an in vitro model of Parkinson´s disease

Morais, Fernando Jorge Teodoro Duarte Garcia

http://hdl.handle.net/10400.8/5144

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Authors

Morais, Fernando Jorge Teodoro Duarte Garcia

Advisor(s)

Pedrosa, Rui Filipe Pinto

Gaspar, Helena

Martins, Alice Isabel Mendes

Abstract(s)

O aumento da esperança média de vida tem levado a um crescimento da população idosa, originando uma prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP). Por outro lado, nos últimos anos, o ambiente marinho tem-se destacado como uma relevante fonte de novos compostos com diversas atividades biológicas, e com potencial aplicação no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Deste modo, o objetivo desta dissertação de mestrado centrou-se na extração, caraterização e avaliação do potencial antioxidante e neuroprotetor de polissacarídeos sulfatados (PSs) isolados a partir de macroalgas vermelhas (Asparagopsis armata, Plocamium cartilagineum e Sphaerococcus coronopifolius), castanhas (Sargassum muticum, Bifurcaria bifurcata e Fucus spiralis) e verdes (Codium tomentosum) recolhidas na costa portuguesa. Os PSs foram obtidos através de uma extração química e enzimática. Seguiu-se a respetiva caraterização química preliminar através da quantificação do conteúdo de açúcares totais (método colorimétrico Fenol-H2SO4), de grupos sulfato (método turbidimétrico BaCl2-Gelatina) e de proteína total (método de Bradford). A presença de grupos funcionais caraterísticos dos PSs foi detetada por espetroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR). A capacidade antioxidante foi avaliada com recurso aos ensaios de redução do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), capacidade de redução do ião ferro3+ (FRAP), e capacidade de absorção dos radicais de oxigénio (ORAC). Determinou-se também o conteúdo em polifenóis totais (TPC) pelo método de Folin-Ciocalteu de modo a estabelecer uma relação entre este parâmetro e a atividade antioxidante. O potencial neuroprotetor foi estudado num modelo celular in vitro da doença de Parkinson induzido pela neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) nas células de neuroblastoma humano (SH-5Y5Y). Adicionalmente, foram estudados os mecanismos celulares associados ao desenvolvimento da DP, tais como: quantificação de espécies reativas de oxigénio, alterações do potencial de membrana mitocondrial, atividade da caspase-3 e fragmentação de DNA. No processo de extração dos SPs observaram-se rendimentos semelhantes para as algas vermelhas e castanhas, tendo o rendimento variado entre 12,39% e 18,23%, enquanto que para a alga verde C. tomentosum se obteve um rendimento de 1,17%. Relativamente à caraterização química preliminar, os PSs de C. tomentosum apresentaram a maior quantidade de açúcares totais (494,89 ± 34,09 μg eq. D-glucose.mg-1 de PSs), os PSs provenientes de A. armata apresentaram a maior quantidade de sulfatos (480,90 ± 5,98 μg eq. Na2SO4.mg-1 de PSs) e os PSs de S. muticum apresentaram o maior conteúdo proteico (43,66 ± 2,47 μg eq. BSA.mg-1). Inversamente, os PSs de F. spiralis apresentaram a menor quantidade de açúcares totais (57,15 ± 10,41 μg eq. D-glucose.mg-1 de PSs), os PSs provenientes de B. bifurcata apresentaram o menor conteúdo em sulfato (148,30 ± 6,89 μg eq. Na2SO4.mg-1 de PSs) e os PSs isolados de S. coronopifolius apresentaram o menor teor proteico (1,48 ± 0,51 μg eq. BSA.mg-1). No que diz respeito à análise química por espetroscopia de IV, os PSs apresentaram bandas características dos principais grupos funcionais (O-H, C-H, C-O-S) presentes em polissacarídeos sulfatados. Quanto às atividades biológicas, os PSs obtidos a partir das algas castanhas exibiram o maior potencial antioxidante, especialmente evidenciado pelo ensaio de DPPH, tendo-se obtido valores de EC50 (μg.mL-1) de 162,00 (F. spiralis), 310,00 (S. muticum), 338,50 (B. bifurcata) e 220,03 (padrão BHT) μg.mL-1. No ensaio de ORAC, os PSs de S. muticum exibiram o valor mais elevado de ORAC (464,8 μmol eq. Trolox.g-1 de PSs) seguido pelos PSs de F. spiralis (298,1 μmol eq. Trolox.g-1 de PSs) e pelo padrão BHT (142,3 μmol eq. Trolox.g-1). De forma semelhante, os PSs isolados a partir de algas castanhas mostraram possuir o maior conteúdo em compostos fenólicos, tendo os PSs de F. spiralis (51,17 mg eq. ácido gálico. g-1 de PSs) apresentado o valor mais alto. Antes de se avaliar o potencial neuroprotetor dos PSs, realizou-se um ensaio de citotoxicidade utilizando o método do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio). Nenhum dos PSs exibiu citotoxicidade abaixo dos 60 μg.mL-1. Relativamente ao ensaio de neuroprotecção utilizando o modelo de neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA, quando administrados juntamente com a 6-OHDA, os PSs de F. spiralis apresentaram a melhor atividade (67,67% de viabilidade celular) ao passo que, quando as células foram sujeitas a uma pré-incubação de 1 h, os PSs de S. muticum foram os que revelaram um melhor potencial (73.49% de viabilidade celular). Ambos os PSs demonstraram a capacidade de diminuir a quantidade de espécies reativas de oxigénio formadas nas células, juntamente com uma atenuação da indução da atividade da caspase-3, quando na presença da 6-OHDA. Os dados obtidos sugerem que o efeito neuroprotetor dos PSs isolados a partir da alga F. spiralis e S. muticum poderá estar relacionado com a sua atividade antioxidante uma vez que estes reduziram a quantidade de espécies reativas de oxigénio produzidas em consequência da exposição das células à neurotoxina 6-OHDA. Em suma, este trabalho demonstrou que os PSs provenientes de algas marinhas, em especial os que apresentam um alto potencial antioxidante, podem ser uma fonte promissora de novos fármacos neuroprotetores com aplicação terapêutica para doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson.