Valente, Joana Filipa Abreu PereiraChagas, Bárbara FerreiraFernandes, Joana Corrêa Mendes de Sousa2024-09-062024-07-25http://hdl.handle.net/10400.8/10020In developed countries with high life expectancies, colorectal cancer (CRC) ranks as the third most common cancer and the second deadliest globally. In 2022 alone, over 1.9 million cases were diagnosed, with CRC causing more than 900.000 deaths annually. Projections indicate a potential increase to 2.5 million cases per year by 2035. Adenocarcinoma, primarily originating from mucus-producing cells, constitutes over 90% of CRC cases. The prognosis of CRC significantly hinges on disease stage, treatment regimen, and patient conditions. The tumour suppressor protein p53 plays a pivotal role in regulating cell growth and preventing tumour formation and is often mutated, or inactivated in CRC cancer cells, making it a prime target for therapeutic intervention. Proper p53 function enables DNA repair or initiates programmed cell death (apoptosis) in cells with irreparable DNA damage, thwarting cancer cell proliferation. Low expression or loss of p53 function in CRC cells is common and can lead to increased genomic instability, impaired DNA repair, and resistance to apoptosis, thereby promoting tumour progression and aggressiveness. Additionally, low p53 expression correlates with chemotherapy resistance and poorer prognosis in CRC patients. Genetic therapy in CRC presents a tailored approach to fight against the disease at a genetic level. One promising strategy involves using plasmid DNA (pDNA) carrying the tp53 gene to restore or enhance p53 function within CRC cells. This targeted genetic intervention holds the potential to inhibit tumour growth, induce cancer cell death, and overcome resistance mechanisms encountered in conventional CRC therapies. However, pDNA's susceptibility to degradation leads to the need to use a delivery system to transport it to target cells. In this context, a growing interest in using natural polymers from renewable sources as biomaterials, such as alginate nanoparticles emerge as promising carriers due to their inert, biocompatible, and easily manipulable properties, with crosslinking achievable through divalent ions without adverse host effects. In this context, the present work focuses on the development of a simple and sustainable process for the extraction and purification of sodium alginate (SA) from brown Sargassum muticum and Saccorhiza polyschides aiming to develop DNA-loaded alginate nanoparticles. These nanoparticles were further characterized and tested in CRC cell lines (CaCo-2) and healthy cells (fibroblasts). Overall, the extraction and purification process parameters play a key role and significantly influence the quality of alginate and the extraction yield. Research efforts are focused on achieving simple and sustainable alginate extraction technologies to improve process efficiency, enhance extraction capacity, reduce cost and promote environmental friendliness. Alginate extraction from brown seaweed S. muticum and S. polyschides showed an optimized yield of SA extraction during 24 hours at 40 °C yielding 20% and 22%, respectively. Characterization wise, H-NMR, FT-IR, viscosity, molecular weight, and Thermal behaviour were studied. Throught this evaluation the efficiency and purity of the extraction were proved. Regarding the development of alginate nanoparticles, the optimized nanoparticle formulation showed a medium size of 167.9 ± 2.49 nm, a PDI of 0.1608 ± 0.009, and a stable zeta potential around 0 mV. Encapsulation efficiency reached 97%, with negligible changes in size when loaded with pDNA. Release tests indicated faster release at lower pH levels and a lower swelling behaviour for lower pH. At 72 hours CaCo-2 transfected with loaded nanoparticles exhibited a 30% diminish in cell viability, in healthy cells, the alginate-base nanocarrier didn’t show any cytotoxic effect.Em países desenvolvidos com alta expectativa de vida, o cancro colorretal (CCR) é globalmente o terceiro tipo de cancro mais comum e o segundo mais mortal. Apenas em 2022, foram diagnosticados mais de 1,9 milhões de casos, sendo responsável por mais de 900,000 mortes anualmente. Projeções indicam um potencial aumento para 2,5 milhões de casos por ano até 2035. O adenocarcinoma, originado principalmente de células produtoras de muco, constitui mais de 90% dos casos de CCR. O prognóstico de CCR depende aignificativamente do estágio da doença, do regime de tratamento e das condições do paciente. A proteína supressora de tumores p53 desempenha um papel fundamental na regulação do crescimento celular e na prevenção da formação de tumores. A função adequada da p53 facilita a reparação do DNA ou inicia a morte celular programada (apoptose) em células com danos irreparáveis no DNA, impedindo a proliferação de células cancerígenas. A baixa expressão ou perda de função da p53 em células de CCR é comum e pode levar ao aumento da instabilidade genómica, prejudicando a reparação de DNA e levando à resistência à apoptose, promovendo assim a progressão e a agressividade do tumor. Além disso, a baixa expressão de p53 está correlacionada com a resistência à quimioterapia e um pior prognóstico em pacientes com CCR. A terapia genética no CCR apresenta-se como uma abordagem personalizada para combater a doença a nível genético. Uma estratégia promissora envolve o uso de DNA plasmidial (pDNA) portador do gene TP53 para restaurar ou aprimorar a função da p53 dentro das células de CCR. Essa intervenção genética direcionada tem o potencial de inibir o crescimento do tumor, induzir a morte das células cancerígenas e superar os mecanismos de resistência encontrados nas terapias convencionais para o CCR. No entanto, a suscetibilidade do pDNA à degradação exige um sistema de entrega para transportá-lo até as células-alvo. As nanopartículas de alginato surgem como portadores promissores devido às suas propriedades inertes, biocompatíveis e facilmente manipuláveis, com a reticulação alcançável por meio de iões divalentes sem efeitos adversos ao hospedeiro. Neste contexto, o presente trabalho centra-se no desenvolvimento de um processo simples e sustentável para a extração e purificação de alginato de sódio a partir das algas castanhas Sargassum muticum e Saccorhiza polyschides com o objetivo de desenvolver nanopartículas de alginato carregadas com ADN. Estas nanopartículas foram ainda caracterizadas e testadas em linhas celulares de CRC (CaCo-2) e células audáveis (fibroblastos). Em geral, os parâmetros do processo de extração e purificação desempenham um papel fundamental e influenciam significativamente a qualidade do alginato e o rendimento da extração. Os esforços de investigação centram-se na obtenção de tecnologias de extração de alginato simples e sustentáveis para melhorar a eficiência do processo, aumentar o rendimento de extração, reduzir os custos e promover o respeito pelo ambiente. A extração de alginato a partir de algas castanhas S. muticum e S. polyschides mostrou um rendimento de extração optimizado de alginato de sódio durante 24 horas a 40 °C, produzindo 20% e 22%, respetivamente. Foram efetuados estudos de caraterização, H-NMR, FT-IR, viscosidade, peso molecular e perfil térmico. No que diz respeito ao desenvolvimento de nanopartículas de alginato, a formulação optimizada das nanopartículas apresentou um tamanho médio de 167,9 ± 2,49 nm, um PDI de 0,1608 ± 0,009 e um potencial zeta estável em torno de 0 mV. A eficiência de encapsulação atingiu 97%, com alterações negligenciáveis no tamanho quando carregadas com pDNA. Os testes de libertação indicaram uma libertação mais rápida a níveis de pHs mais baixos e um comportamento de retanção de água mais baixo para pHs mais baixo. Após 72 horas, as células CaCo-2 transfectadas com nanopartículas carregadas apresentam uma diminuição de 30% da viabilidade cellular, em células saudáveis, as nanoparticulas à base de alginato não apresentaram qualquer efeito citotóxico.engAlginate extractionAlginate nanoparticlesp53 encoding pDNAColorectal cancermaster thesis203691113